大豆ERECTA响应荫蔽胁迫的机理研究

摘要

玉米大豆带状套作种植模式是在传统的间套作基础上发展出的新的种植模式，保障了玉米和大豆的产量，提高了土地当量比。但是，高位作物玉米形成了荫蔽环境，光质和光强发生了剧烈的变化。大豆幼苗的生长受到荫蔽环境的影响，植株出现避荫反应综合征，最终导致大豆产量降低。因此，探究大豆避荫反应的分子机理具有重要意义。ERECTA是一个编码富含亮氨酸重复序列的植物类受体激酶。研究表明:拟南芥中的ERECTA参与避荫反应。但是，大豆的ERECTA荫蔽胁迫下表达调控机制尚不清楚。本研究从大豆ERECTA入手，从分子水平上阐释大豆ERECTA同源基因（GmERs）在避荫反应中的表达调控机理。
　　本研究选用对荫蔽敏感的南032-4（由地方品种“忠县十月黄”经60Coγ射线辐射后产生的变异后代）和拟南芥野生型Col-0及ERECTA(AtER)基因的缺失突变体(er)作为实验材料，开展植物响应荫蔽胁迫的分子机理研究，研究结果如下:
　　1.在绿膜模拟的荫蔽环境下，南032-4和拟南芥Col-0、er突变体的表型均出现了相似的避荫反应综合征:南032-4表现出下胚轴、株高、节间增长，茎干变细，叶面积减小的表型;拟南芥Col-0和er突变体也出现下胚轴、叶柄伸长，叶面积减小的表型，但是er突变体对荫蔽环境不敏感。可见，大豆和拟南芥采用相似的避荫策略来适应荫蔽环境。其中，下胚轴的长度可以作为大豆和拟南芥产生避荫反应的一个重要参数。
　　2.荫蔽环境下，南032-4叶片光合速率、胞间CO2浓度、气孔导度和蒸腾速率均显著降低。可见，荫蔽胁迫降低了南032-4的光合作用强度。
　　3.通过在数据库中对GmERs的检索和序列比对发现GmERs有4个，分别是GmERa(Glyma04g05912),GmERb(Glyma06g05900),GmERc(Glyma14g11220)和GmERd(Glyma17g34380)，它们与拟南芥中的AtER基因序列高度相似，且分为了两支。通过RT-PCR检测发现，GmERs的表达具有组织特异性。它们在南032-4地上分生组织中均有较高的表达量。
　　4.通过RT-PCR检测发现，与正常光照相比，在荫蔽胁迫下，GmERs表达量均有升高，且GmERs在不同组织中表达有差异。同时，在荫蔽胁迫下，拟南芥Col-0中AtER表达量也显著升高。这表明GmERs和AtER均参与避荫反应。
　　5.通过Gateway克隆GmERa的CDS序列以及GmERa，GmERb，GmERc和GmERd的启动子（GmERap，GmERbp，GmERcp，GmERdp）。成功构建为pBASTA-35S-GmERa-GFP,pBA STA-GmER ap-G US,pBASTA-GmERbp-GUS,pBASTA-GmERcp-GUS，pBASTA-GmERdp-GUS。重组质粒转化农杆菌GV3101，浸染拟南芥Col-0和er，通过喷施Basta和RT-PCR鉴定得到转基因植株。
　　6.含GmERa的拟南芥转基因植株可以恢复er的表型:叶面积和叶柄长度均大于野生型Col-0。结果表明:荫蔽胁迫下，GmERa的转基因植株的下胚轴显著伸长。
　　7.荫蔽胁迫下，拟南芥er phyb双突纯合体下胚轴显著伸长，但比phyb单突短。不同浓度的赤霉素:Gibberellin(GA3:0.5μM、1μM、2μM和5μM)、生长素类似物:Picloram（PIC:0.5μM、1μM、2μM和5μM）、乙烯前体:Aminocyclopropanecarboxylic Acid(ACC:0.01μM、0.1μM、1μM和10μM)、表油菜素内酯:Brassinosteroids（24-epiBL:0.01μM、0.05μM、0.5μM和1μM）、多效唑:Paclobutrazol(PAC:0.5μM)和萘基邻氨甲酰苯甲酸:Naphthyphthalamicacid(NPA:0.5μM)激素处理，GA3、PIC、ACC和24-epiBL均能促进Col-0、er、phyb和er phyb下胚轴的伸长。其中，荫蔽环境下，GA3能够显著地促进er下胚轴的伸长，并与Col-0下胚轴的长度无差异;而PIC、ACC、24-epiBL则不能。同时，荫蔽环境下，与NPA相比，PAC更能显著抑制下胚轴的伸长。这表明，ER促进下胚轴的伸长部分依赖于光敏色素PHYB，且植物激素GA3参与ER介导的避荫反应。
　　8.荫蔽胁迫下，拟南芥AtER，AtERL1和AtERL2启动子的转基因植株经GUS染色后，与正常光照相比，拟南芥AtER、AtERL1和AtERL2表达量升高。这表明AtER参与避荫反应，且三个基因在各组织表达程度不同。经过GA3、PIC、ACC、24-epiBL激素处理，无论正常光照或荫蔽处理，拟南芥AtER，AtERL1和AtERL2表达量都比空白对照高。同时，荫蔽处理能进一步提高AtER，AtERL1和AtERL2表达量。其中，在GA3和PIC处理下，拟南芥转基因植株GUS染色更深。同时荫蔽胁迫下，含大豆GmERs启动子的拟南芥转基因植株经GUS染色后，与正常光照相比，GmERs在子叶、叶柄和下胚轴中的表达量上升。这表明，GmERs参与避荫反应。
　　9.采用荧光定量PCR试验检测拟南芥下胚轴中GA和IAA信号通路相关基因，结果表明:在荫蔽处理下，拟南芥Col-0和er下胚轴中AtIAA29、AtGA3OX1、AtGA20OX1、AtPIL1、AtPIF4、AtSA UR68、AtRGA1表达量在荫蔽处理下升高，且Col-0中的相关基因表达量高于er，而AtGA2OX1，AtGA1表达量基因表达量则有降低。这表明，GA和IAA信号通路相关基因也参与避荫反应的调控。
　　从大豆和拟南芥形态、生理、基因表达研究可以得出ER介导的避荫反应中信号传递通路可能为:质膜上ER感知到外界光环境中低红光与远红光比值，将光信号传递给胞质中的光敏色素PHYB，光敏色素PHYB由Pfr型态转变为Pr型态，进入核内，与转录因子相互作用，进而启动GA和IAA相关基因表达，最终促进植株下胚轴的伸长。

目录

声明

摘要

1 研究背景和意义

2 文献综述

2．1 大豆玉米带状套作复合种植下荫蔽胁迫的研究进展

2．2 植物对荫蔽胁迫的响应

2．3 光受体介导的避荫反应及与受体激酶的关系

2．4 植物受体激酶参与的避荫反应

3 材料与方法

3．1 实验材料和试剂

3．2 植株生长条件

3．3 实验方法

3．3．1 大豆和拟南芥表型性状的测定

3．3．2 光合特性测定

3．3．3 序列比对

3．3．4 进化树构建

3．3．5 引物设计

3．3．6 RT-PCR检测GmERs的组织特异性表达

3．3．7 RT-PCR检测荫蔽相关基因表达

3．3．8 Gateway基因克隆

3．3．9 GmERa和启动子的PCR扩增和重组质粒的构建

3．3．10 拟南芥转基因植株的构建

3．3．11 GUS染色

3．3．12 拟南芥er phyB双突变体构建

3．3．13 植物激素处理

3．3．14 qPCR检测拟南芥在荫蔽胁迫下相关基因的表达

3．3．15 数据处理

4 研究结果

4．1 荫蔽胁迫下南032-4植株产生避荫反应综合征

4．2 荫蔽胁迫下拟南芥植株产生避荫反应综合征

4．3 荫蔽胁迫降低了大豆植株叶片光合特性参数

4．4 大豆基因组中含有4个GmER同源基因

4．5 GmERs的表达具有组织特异性

4．6 荫蔽胁迫能诱导GmERs的上调表达

4．7 荫蔽胁迫能诱导AtER的上调表达

4．8 GmERa CDS和GmERs启动子克隆

4．9 GmERa可以恢复er表型

4．10 荫蔽胁迫下GmERa促进er下胚轴伸长

4．11 荫蔽胁迫下GmERs具有时空表达差异性

4．12 荫蔽胁迫下ER调控下胚轴的伸长部分依赖于PHYB

4．13 植物激素参与ER介导的避荫反应

4．13．1 GA3参与调控ER介导的避荫反应

4．13．2 PIC参与调控ER介导的避荫反应

4．13．3 ACC参与调控ER介导的避荫反应

4．13．4 24-epiBL参与调控职介导的避荫反应

4．14 荫蔽胁迫和植物激素处理下AtER的时空表达

4．14．1 荫蔽胁迫下AtER具有时空表达差异性

4．14．2 荫迫蔽胁和GA3处理下AtER具有时空表达差异性

4．14．3 荫蔽胁迫和PIC处理下AtER具有时空表达差异性

4．14．4 荫蔽胁迫和ACC处理下AtER具有时空表达差异性

4．14．5 荫蔽胁迫和24-epiBL处理下AtER具有时空表达差异性

4．15 荫蔽胁迫提高了拟南芥GA和IAA信号通路基因的表达量

4．16 荫蔽胁迫提高了大豆GA和I从信号通路基因的表达量

5 分析与讨论

6 问题与展望

参考文献

致谢