FOXO3基因在鸡卵泡中的表达及其对颗粒细胞增殖凋亡的影响

摘要

FOXO3（又名叉头盒（forkhead）转录因子3a)，属于叉头盒(FOX)超家族中O亚家族的成员。研究表明，FOXO3基因可受PI3k/Akt信号通路调控，通过磷酸化的PI3K激活Akt，导致FOXO3基因磷酸化，使其丧失转录活性，从而防止细胞凋亡。在哺乳动物卵巢中，FOXO3基因可以通过促进卵巢颗粒细胞凋亡来调节卵泡的闭锁及生长，所以，推测FOXO3基因可能是导致禽类卵泡闭锁的重要调控因子。因此，本试验以鸡为研究对象，首先利用荧光定量PCR和免疫荧光技术检测FOXO3基因在鸡不同组织以及不同阶段卵泡中的mRNA表达和蛋白表达的差异。其次，在鸡原代卵巢颗粒细胞中，通过干扰技术检测FOXO3基因被干扰后，PI3K/Akt通路下游相关凋亡基因、FOXO3的靶向基因以及三种激素受体基因ERβ、FSHR、LHR的mRNA表达情况;并通过外源添加不同浓度的FOXO3蛋白检测通PI3K/Akt通路下游相关凋亡基因、FOXO3的靶向基因以及三种激素受体基因的mRNA表达情况;最后，通过添加不同浓度的E2、FSH、LH激素检测鸡卵巢颗粒细胞的增殖情况，并检测FOXO3基因和三种激素受体基因的mRNA表达情况。结果表明:
　　(1)FOXO3基因在鸡不同繁殖组织和各等级卵泡中均有表达，且在等级卵泡中的表达量随卵泡直径的增大而降低。在等级卵泡中，FOXO3基因在F1卵泡中的表达量最低，显著低于其在F2和F3等级卵泡中的表达量(P＜0.05)，极显著低于F4和F5中的表达量(P＜0.01)，而FOXO3基因在F4和F5卵泡中的表达量差异不显著(P＞0.05);在等级前卵泡中，FOXO3基因在LWF中的表达量极显著低于SYF(P＜0.01)，并且与SWF中的表达量差异显著(P＞0.05)。
　　(2)在鸡原代卵巢颗粒细胞中干扰FOXO3基因后，PI3K/Akt信号通路下游相关凋亡基因BCL2L11、Bnip3以及FOXO3的靶向基因CDKN1B、FASLG的表达均没有显著变化(P＞0.05)，且FSH、E2、LH的受体基因FSHR、ERβ、LHR的表达量也没有显著变化(P＞0.05)。
　　(3)鸡原代卵巢颗粒细胞中外源添加FOXO3蛋白后，FOXO3基因的表达量会发生变化，其中高浓度处理组显著高于低浓度处理组(P＜0.05)。Bnip3基因在高浓度处理组中的表达量显著高于其他组(P＜0.05)，而在其它不同浓度组中的差异不显著(P＞0.05);CDKN1B基因，在高浓度处理组中差异显著(P＜0.05);而BCL2L11、FASLG基因在不同浓度的FOXO3外源蛋白中表达的差异均不显著(P＞0.05);相关激素受体基因ERβ、FSHR和LHR的表达差异也均不显著(P＞0.05)。
　　(4)鸡颗粒细胞中添加不同浓度的E2、FSH和LH后，造成颗粒细胞发生不同程度的增殖(P＜0.05)，添加不同浓度的LH后，颗粒细胞出现凋亡现象;在E2、FSH处理的颗粒细胞中，高浓度处理组中的颗粒细胞显著增殖(P＜0.01);在LH处理的颗粒细胞中，颗粒细胞OD值显著下降(P＜0.05)。添加不同浓度E2导致ERβ基因表达量显著上调(P＜0.05)，FOXO3基因表达量显著下调(P＜0.05);添加不同浓度的FSH导致FSHR基因表达在处理组中显著高于对照(P＜0.05)，而FOXO3基因在对处理组中的表达则显著低于对照组(P＜0.05);添加不同浓度的LH导致LHR基因表达在高浓度处理组中显著上调(P＜0.05)，而FOXO3基因在不同浓度处理组中的表达量差异不显著(P＞0.05)。
　　综上所述，无论是在鸡不同繁殖组织、卵泡，还是在鸡卵巢颗粒细胞中，FOXO3基因均有所表达，并表现出具有促使鸡颗粒细胞凋亡的功能，但不能直接调控激素受体基因ERβ、FSHR、LHR。因此E2、FSH、LH与FOXO3之间的在鸡卵泡中的调控关系有待进一步本探究。本试验结果可为更深入的探索FOXO3基因在鸡卵泡发育过程中的调控作用，并揭示鸡卵泡发育差异的分子机制提供参考依据。

目录

论文说明

声明

摘要

缩写对照表

1文献综述

1．1家禽卵泡发育概述

1．1．1家禽卵泡的发育特点

1．1．2影响家禽卵泡发育的因素

1．2家禽颗粒细胞研究进展

1．2．1家禽卵泡颗粒细胞在卵泡发育中的作用

1．2．2家禽卵泡颗粒细胞对卵泡闭锁的影响

1．2．3影响家禽卵泡颗粒细胞增殖和凋亡的因素

1．3FOXO3的研究进展

1．3．2FOXO3基因的发现与结构

1．3．3FOXO3基因的在信号通路PI3K/Akt中的作用

1．3．4FOXO3基因调控卵巢功能

1．4本研究的主要内容和目的意义

1．4．1主要内容

1．4．2目的意义

2材料与方法

2．1试验动物

2．2试剂与耗材

2．2．1主要试剂及试剂盒

2．2．2常用试剂的配制

2．2．3主要仪器设备

2．2．4主要应用的生物学软件

2．3试验方法

2．3．1样品采集

2．3．2 cDNA模板的制备

2．3．3鸡等级前、等级卵泡的免疫荧光

2．3．4鸡原代颗粒细胞的分离培养

2．3．5荧光定量PCR

2．3．6数据统计分析

3结果与分析

3．1．2 FOXO3基因在鸡下丘脑、垂体，卵巢和输卵管中的表达

3．2 FOXO3基因在鸡各阶段卵泡中的表达

3．2．2FOXO3蛋白在鸡不同阶段卵泡中的免疫荧光结果

3．3FOXO3基因对鸡颗粒细胞增殖与凋亡的影响

3．3．1鸡卵泡颗粒细胞的形态学观察与培养结果

3．3．2 FOXO3转染siRNA位点的选取

3．3．3干扰FOXO3后PI3K/Akt信号通路相关凋亡基因的表达结果

3．3．4干扰FOXO3基因对FSH、E2、LH受体基因表达的影响

3．4外源添加FOXO3蛋白对体外培养颗粒细胞凋亡的影响

3．4．1添加FOXO3蛋白的颗粒细胞凋亡相关基因的表达结果

3．4．2添加FOXO3蛋白的颗粒细胞相关激素受体基因的表达结果

3．5添加外源激素对体外培养鸡卵泡颗粒细胞增殖的影响

3．5．1添加E2对体外培养鸡卵泡颗粒细胞的影响

3．5．2添加FSH对体外培养鸡卵泡颗粒细胞的影响

3．5．3添加LH对体外培养鸡卵泡颗粒细胞的影响

4讨论

4．2FOXO3对颗粒细胞凋亡关键基因的影响

4．3FOXO3对颗粒细胞增殖的影响

5．结论

参考文献

致谢

作者简历