不同倍性水稻基因组甲基化、基因表达和sRNA的研究

摘要

多倍体是指包含超过两套染色体组的细胞、组织或生物。多倍体在植物中很常见，据估计，目前的植物种类中有30-80％是多倍体，有证据显示，许多二倍体植物的基因组曾经历过一次或多次古多倍体的过程，被子植物多样性的大爆炸与许多植物同时发生的古基因组复制事件的时间正好吻合。此外，约有15％的被子植物和31％的蕨类植物物种形成事件伴随着倍性增加的过程。多倍体植物可以通过几种机制自发产生，包括减数分裂和有丝分裂失败，未减数配子融合等。由于多倍体植物具有组织器官增大、生物学产量增加、抗逆性增强等特点，因而广泛应用于作物育种领域。
　　本研究所用材料SARII-628是一个能够自然发生多胚苗的稳定水稻品系，多胚苗包含单倍体、二倍体、三倍体和四倍体，以其中的单倍体、二倍体和三倍体为材料，通过分离其分蘖和合理的栽培管理形成三个倍性株系。用体细胞染色体计数确定倍性，并利用均匀分布于基因组上的6000个SNP标记检测发现，三个倍性材料遗传背景高度一致。进一步评估它们的多种农艺性状，结果表明三个倍性水稻在株高、颖花大小、剑叶长宽等性状方面有较大差异，这意味着基因组加倍引起了巨大的表型变化，由此希望了解表观基因组的变化对基因表达产生的影响。利用该套倍性水稻材料研究在基因组DNA序列不变的情况下，DNA甲基化和miRNAs对基因表达变化的影响，可以在一定程度上模拟全基因组复制过程中表观基因组的变化规律及其对基因表达的影响。本研究获得的主要结果如下:
　　MeDIP-seq研究结果表明，三个倍性水稻基因组DNA甲基化方式高度相似，这表现在基因组各区域甲基化分布没有差异，甲基化水平呈现相同的趋势。基因功能区DNA甲基化主要富集在启动子区，启动子区甲基化水平稍有差异，表现为三倍体高于二倍体，二倍体高于单倍体。TEs区的甲基化水平表现为单倍体与二倍体相当，三倍体甲基化水平最低。
　　DNA甲基化和基因表达方式联合分析显示，在倍性水稻中转录起始位点上游DNA甲基化水平与基因的表达水平呈正相关;而gene body区DNA甲基化与基因表达水平呈弱负相关。基因启动子区的甲基化分析显示，三个倍性水稻启动子区具有甲基化的基因分别有25425(1N)，24894(2N)和25082(3N)个。启动子区甲基化水平差异分析发现在1N和2N，3N和1N，2N和3N之间分别有1325，258和1527个基因在启动子区具有甲基化差异。倍性水稻TEs区虽然具有甲基化差异，但TEs附近的基因表达水平在三个样本中没有显著差异。
　　倍性水稻中大约有25500个甲基化基因，其中22751个基因在三个倍性水稻中都被甲基化，约有16％的基因在不同的倍性水稻之间甲基化水平具有显著差异，但只有64个基因甲基化水平在三个倍性水稻之间都有明显差异。降低差异标准为1.5倍后，发现87个基因随倍性增加甲基化水平上调，GO分析显示功能显著地富集在锂离子转移和不同离子动态平衡方面，与抗性有关;150个基因随倍性增加甲基化水平下调，GO分析显示功能显著富集在依赖RNA的DNA复制、胚乳发育、组蛋白甲基化和核小体装配等。另外，当倍性发生改变，单倍体和三倍体中分别有937和1167个基因发生了从头甲基化，702个基因发生了去甲基化。
　　通过进行不同倍性水稻small RNA文库高通量测序，分析显示有27个miRNAs的表达水平在倍性水稻之间有显著差异，并且有些miRNA只在其中一个倍性水稻中表达。利用更严格的标准分析候选miRNAs的次级结构，并用液相杂交的方法验证了两个miRNAs的真实性。以日本晴为供体，转基因过表达osa-miR6＃和osa-miR7＃前体，T0代阳性植株与野生型比较出现了各种微小的表型变化，进一步的表型鉴定和靶基因表达水平分析正在进行中。
　　综上，本文研究发现，在水稻中随着倍性变化全基因组甲基化变化并不是广泛发生，少数基因的甲基化水平出现差异，引起了一些局部的与植物适应性和代谢相关的基因表达变化;水稻基因组复制亦仅引起了部分miRNAs的表达变化。这些表观变化的意义可能是染色体复制过程中适度的表观变化即维持了基因组的稳定性，也使基因组具有一定的可塑性。

目录

声明

摘要

第一章文献综述

1．1．1多倍体植物的应用

1．1．2多倍化植物的生理生化、生长发育和形态性状特征

1．1．3多倍化对植物结构基因组及表达的影响

1．1．4多倍化后表观修饰的变化

1．2植物表观遗传学研究

1．2．1 DNA甲基化

1．2．2 microRNA(miRNA)

1．3本研究的目的及意义

第二章材料和方法

2．1三个倍性材料的获得、染色体数目鉴定、6K芯片鉴定

2．1．1倍性材料的获得和染色体数目鉴定

2．1．2 6K芯片检测

2．2 DNA甲基化免疫共沉淀和Illumina Genome Analyzer测序

2．3 DGE(Digital gene expression profiling)文库构建及测序

2．4 sRNA文库构建和测序

2．5 small RNA数据的计算机分析

2．6液相杂交

2．7 miRNAs过表达载体构建及转化

第三章结果与分析

3．1三个倍性水稻遗传背景高度相似而表型差异明显

3．2倍性水稻全基因组甲基化方式具有高度相似性

3．2．1单倍体、二倍体和三倍体水稻甲基化图谱高度相似

3．2．2倍性水稻基因组甲基化分布高度相似

3．2．3倍性水稻基因组各功能区甲基化水平趋势相同，但有一定差异

3．3倍性水稻在基因水平上的甲基化具有差异

3．3．1倍性水稻中的DNA甲基化基因

3．3．2倍性水稻中差异甲基化基因分析

3．3．3基因启动子区甲基化及差异分析

3．4倍性水稻DNA甲基化与基因表达

3．5 small RNA对倍性水稻的影响

3．5．1单倍体中基因表达、sRNA和DNA甲基化的关系

3．5．2 siRNA与DNA甲基化的相关性

3．5．3 1N、2N和3N中已知miRNAs

3．5．4新的候选miRNAs的鉴定

第四章讨论

4．1同源多倍体DNA甲基化研究的意义

4．2三个倍性水稻基因组甲基化方式的变化

4．3同源倍性水稻中基因的表达变化的原因

4．4 DNA甲基化与基因表达的关系

4．5多倍体中DNA甲基化和miRNAs存在的意义

4．5结论和展望

参考文献

致谢

附录

作者简历