红苞凤梨VIGS基因沉默体系的建立及POR基因的克隆与功能验证

摘要

红苞凤梨(Ananas comosus var.bracteatus)由于其叶片嵌合形状多样且明显，成为一种重要的新型观赏植物。嵌合性状在组织培养过程中很不稳定，再生植株中嵌合型植株数量稀少。探究叶色镶嵌的形成机理，对提高繁育过程中嵌合性状的稳定性有着重要的意义。本文通过组织培养得到嵌合性状分离的全白植株和全绿植株，通过分析两种植株光合色素合成相关生理指标和基因表达的差异，筛选出导致叶片白化的关键基因为POR基因。通过建立VIGS基因沉默体系，得到一种快速获得转基因植株鉴定基因功能方法。并对POR基因进行了克隆、表达分析和功能验证，探究其对红苞凤梨叶片白化的影响，为深入分析红苞凤梨白化细胞失绿突变的分子机理提供理论依据，对提高红苞凤梨嵌合性状的稳定性，促进红苞凤梨的工厂化育苗具有重要的实践意义。获得的主要研究结果如下:
　　1、通过对EF1、UBQ、ACT、GADPH、Histone、TUA、TUB、18S、elf-5A、α-tubulin10个候选基因在红苞凤梨不同生长阶段、全绿和全白叶样品中进行RT-qPCR表达模式分析，筛选出红苞凤梨不同生长发育时期最适内参基因是Histone和α-tubulin，18s、EF1和α-tubulin的内参组合在全绿苗和全白苗的对比分析时最理想。采用PetF基因验证筛选结果，证明所选的内参基因合适。
　　2、以红苞凤梨全绿植株和全白植株叶片为材料，通过RNA-seq测序，经COG、GO和KEGG功能注释分析，发现DEGs主要在叶绿体发育、叶绿素合成和光合作用途径富集。而叶绿素合成代谢过程中有13个差异表达基因，RNA-seq和Real time qPCR分析表明，13个DEGs中仅2个POR基因在全白植株中下调表达。POR基因可能是红苞凤梨叶片白化细胞失绿突变的关键基因。
　　3、测定了红苞凤梨组培全白和全绿植株的叶绿素合成中间代谢产物及叶绿素的含量。全绿叶片中Pchlide的含量是全白叶片的4倍，经原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)的催化，全绿叶片中Chla的含量是全白叶片的30倍。结合转录组测序结果进行分析，推测POR基因可能是关键基因，POR基因编码的原叶绿素酸酯氧化还原酶抑制可能是导致是细胞失绿白化的关键原因。
　　4、克隆得到2个POR基因的cDNA序列，分别命名为POR1和POR2，两个基因的ORF序列长度分别为1167bp和1218bp，分别编码388和405个氨基酸。导入NCBI进行Blast比对，确定两个基因均是POR基因，属于短链脱氢酶(c-like SDR)家族。这两条核苷酸序列的同源性为73.81％，由碱基推导的氨基酸序列同源性为74.08％。将氨基酸序列与39个不同植物的不同类型POR基因的氨基酸序列进行比对，并建立系统进化树，推测POR1可能为红苞凤梨的PORB基因，POR2为红苞风梨的PORA基因。
　　5、选取PDS基因作为指示基因，使用烟草脆裂病毒为载体，在红苞凤梨中建立VIGS基因沉默体系。构建基因沉默载体PDS-TRV2，利用农杆菌GV3101介导将沉默载体PDS-TRV2和TRV2空载注射红苞凤梨全绿苗。经PCR检测确定病毒在植物内复制并转移，对沉默后的红苞凤梨叶色进行比对，发现转沉默载体的红苞凤梨(Si)和转沉默载体的隔叶(Si-Ge)叶色轻微偏黄，对基因沉默的红苞凤梨类胡萝卜素含量分析表明，Si组和Si-Ge组红苞凤梨类胡萝卜素含量低于阴性对照组(CK)和阳性对照组(P)，说明成功构建红苞凤梨VIGS体系。
　　6、使用构建成功的VIGS体系，分别选取POR1、POR2中各230bp和298bp保守序列，分别构建沉默载体POR1-TRV2和POR2-TRV2，利用农杆菌GV3101介导将两个POR基因沉默载体和TRV2空载注射红苞凤梨全绿苗。RT-qPCR检测发现转沉默载体的红苞凤梨(Ti)POR基因表达量低于阴性对照组(CK)和阳性对照组(P)。对沉默后的红苞凤梨叶色进行比对，Ti1组和Ti1-Ge组红苞凤梨叶色总体偏黄，且Ti1组和Ti1-Ge组叶绿素含量相较两个对照组下降30％，说明Ti1组叶绿素合成受阻;Ti2组和Ti2-Ge组红苞凤梨叶色与两个对照组相近，且Ti2组和Ti2-Ge组叶绿素含量与两个对照组差异不显著，说明Ti2组叶绿素合成未受太大影响。推测POR1基因可能在叶片叶绿素合成过程中发挥较重要的作用。

目录

声明

摘要

缩略词表

前言

1．文献综述

1．1凤梨科植物研究进展

1．1．1凤梨科植物发展现状

1．1．2凤梨科植物转基因技术研究

1．2植物嵌合体机理研究

1．2．1植物嵌合体的类型及产生

1．2．2嵌合体发生的分子机制

1．3 VIGS基因沉默技术及其应用

1．3．1病毒诱导的基因沉默(VIGS)的作用机理

1．3．2影响VIGS的因素

1．3．3 VIGS技术的应用

1．4 POR基因的研究进展

1．4．1POR基因的功能

1．4．2 POR基因在各种植物中的研究进展

1．5本研究的目的与意义

2．红苞凤梨实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选

2．1试验材料

2．2试验仪器及试剂

2．2．1主要试验仪器

2．2．2试验试剂

2．3试验方法

2．3．1引物的设计

2．3．2总RNA的提取和cDNA第一链的合成

2．3．3实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)

2．3．4数据分析

2．3结果分析

2．3．1荧光定量PCR引物的特异性及扩增效率

2．3．2内参基因的筛选

3．红苞凤梨全白、全绿植株表达谱测序分析及关键基因的筛选

3．1试验材料

3．2试验仪器及试剂

3．2．1主要仪器

3．2．2主要试剂

3．3试验方法

3．3．1全白、全绿植株RNA的提取与质量检测

3．3．2表达谱测序

3．3．3表达谱测序信息分析

3．3．4叶绿素合成关键基因的荧光定量表达

3．4结果分析

3．4．1全绿、全白植株细胞间的差异表达基因分析

3．4．2 GO和KEGG途径对DEGs的富集分析

3．4．3全绿、全白植株光合色素生物合成相关DEGs功能注释分析

3．4．4全绿、全白植株叶绿素合成相关基因表达差异分析

3．4．5叶绿素生物合成相关基因Real time qPCR表达分析

4．红苞凤梨叶片叶绿素含量及其合成代谢相关指标的测定

4．1试验材料

4．2主要试验试剂及仪器

4．2．1主要仪器

4．2．2主要试剂

4．3测定项目与方法

4．3．2叶绿素合成前体物质含量测定

4．3．3原叶绿素酸酯氧化还原酶(POR)活性的测定

4．4结果分析

4．4．2叶绿素生物合成前体的评估

4．3．3全绿、全白植株POR酶活性比较

5．红苞凤梨POR基因的克隆及POR序列分析

5．1试验材料

5．2试验仪器及试剂

5．2．1主要仪器

5．2．2主要试剂及配方

5．3试验方法

5．3．1红苞凤梨总RNA的提取

5．3．2 cDNA第一链合成

5．3．3 POR基因全长的扩增和测序

5．4结果分析

5．4．1红苞凤梨总RNA质量的检测

5．4．2 POR基因全长的克隆

5．4．3 POR基因的生物信息学分析

6．红苞凤梨VIGS体系的建立

6．1试验材料

6．2试验仪器及试剂

6．2．1主要仪器

6．2．2主要试剂及配方

6．3试验方法

6．3．1红苞凤梨PDS干扰载体的构建

6．3．2沉默载体质粒冻融法转化农杆菌感受态

6．3．3农杆菌介导的病毒感染

6．3．4红苞凤梨PDS基因沉默的鉴定

6．4结果分析

6．4．1 PDS沉默载体的构建

6．4．2冻融法转化沉默载体质粒

6．4．3红苞凤梨PDS基因沉默的表型分析

6．4．4红苞凤梨PDS基因沉默及类胡萝卜素含量

6．4．5 PDS基因沉默的病毒分子检验及PCR鉴定

7．POR基因的功能验证

7．1试验材料

7．2试验仪器及试剂

7．2．1主要仪器

7．2．2主要试剂及配方

7．3试验方法

7．3．1红苞凤梨POR沉默载体的构建

7．3．2沉默载体质粒冻融法转化农杆菌感受态

7．3．3农杆菌介导的病毒感染

7．3．4红苞凤梨POR基因沉默的鉴定

7．4结果分析

7．4．1 POR沉默载体的构建

7．4．2冻融法转化沉默载体质粒

7．4．3红苞凤梨POR基因沉默及叶绿素含量

7．4．4红苞凤梨POR基因沉默后的POR酶活性

7．4．5 POR基因沉默的病毒分子检验

7．4．6红苞凤梨POR基因荧光定量表达分析

8．结论与讨论

8．1红苞凤梨内参基因的筛选

8．2红苞凤梨叶片白化关键基因的筛选

8．3 POR基因的序列特征及所编码的蛋白质基本性质

8．4红苞凤梨VIGS体系的建立

8．5 POR基因的功能分析

参考文献

致谢