饲料氮利用率不同的山羊胃肠道微生物结构与组成的差异性研究

摘要

反刍动物对饲料氮的利用率较低，食入的氮大部分不是被机体吸收利用，而是排泄到环境中去，从而加重了水体和土壤的氮污染，再加上我国蛋白饲料资源严重不足，因此研究提高反刍动物对饲料氮的利用效率具有重要的学术和生产意义。反刍动物胃肠道中定植着复杂的微生物区系，它们是影响反刍动物对营养物质利用效率的重要因素之一，但是氮利用率不同的动物胃肠道微生物结构与组成的具体差异还不为人所知，为此我们进行了以下的研究。
　　以30只品种、年龄、性别和饲养管理均一致的努比亚黑山羊为试验动物，先进行代谢试验。代谢试验由30天预饲期和6天正试期组成，代谢试验期内所有山羊饲喂同一种全混合日粮（精∶粗=45∶55），单笼饲养。正试期间，收集所有羊只每天排泄的全部粪尿，同时记录每只山羊每天的饲喂量和余料量。代谢试验结束后进行屠宰试验，将所有山羊放血屠宰后，取瘤胃，真胃，空肠，盲肠和结肠的内容物于无菌的EP管中，-80℃冻存，现场检测瘤胃液的pH值。根据代谢试验数据，统计计算30只山羊氮利用率的平均值和标准差，然后挑选氮利用率＞平均数+0.5*标准差的山羊为高氮利用率组(HNU)，氮利用率＜平均数-0.5*标准差的山羊为低氮利用率组(LNU)。选用HNU(8只)和LNU组（7只）共15只试验动物的5个胃肠部位内容物样品，提取其微生物总DNA。以微生物总DNA为模板，用微生物通用引物对(515F:GTGCCAGCMGCCGCGGTAA;806R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT)，针对细菌16S rRNA的V4区进行PCR扩增，然后利用Illumina HiSeq300PE测序平台对PCR产物进行高通量测序，用QIIME等软件对高通量测序结果进行生物信息学分析。用实时定量PCR技术对瘤胃中的7种蛋白降解菌进行定量分析，并对LNU组和HNU组的数据进行显著性检验。结果表明:
　　(1)30只山羊对饲料氮的利用效率在20.71％-67.47％之间高度变异，存在明显的个体差异;HNU组和LNU组的平均氮利用率分别为32.94％±7.34％和56.17％±5.72％，组间差异极显著（P＜0.001）;
　　(2)在门水平上，HNU组和LNU组15只山羊的拟杆菌门和厚壁菌门的相对丰度之后占瘤胃微生物总数的90％以上;真胃中厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门为优势菌门，所占比例分别为44.24％、28.79％和14.16％;空肠中，厚壁菌门占到了63.64％，Lentisphaerae、拟杆菌门和Tenericutes分别占8.04％、7.72％和7.04％;结肠中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，分别占63.76％和20.99％，并且HNU组中广古菌门的相对丰度显著高于LNU组(P=0.047);盲肠中厚壁菌门和拟杆菌门为优势菌门，分别占59.83％和20.80％，并且HNU组中蓝藻菌门(P=0.042)的相对丰度显著高于LNU组;(3)在属水平上，瘤胃中LNU组Prevotella_1（P=0.045）、Succiniclasticum(P=0.013)、p-1088-a5_gut_group(P=0.044)等的相对丰度显著高于HNU组，而Ruminococcus1(P=0.018)、Lachnospiraceae_XPB1014_group(P=0.014)、和Ruminococcaceae_UCG-004(P=0.005)、Ruminobacter(P=0.024)、Family_(ⅩⅢ)_UCG-002（P=0.029）等菌的相对丰度显著低于HNU组;Prevotella_1是山羊瘤胃中的优势菌属，其在HNU和LNU中的平均相对丰度分别为17.63％和12.02％;真胃中LNU组Eubacterium_nodatum_group（P=0.030）和Methanobrevibacter(P=0.044)的相对丰度显著低于HNU组、而Anaerovibrio(P=0.026)的相对丰度显著高于HNU组;空肠中LNU组Ruminococcus_2（P=0.03）和Tyzzerella_3（P=0.05）的相对丰度均显著高于HNU组;结肠中LNU组Anaeroplasma（P=0.042）和Lachnospiraceae_UCG-009（P=0.014）的相对丰度显著高于HNU组;盲肠中LNU组Prevotellaceae_UCG-004（P=0.03）和Thalassospira（P=0.05）的相对相对丰度显著高于HNU组;
　　(4)氮利用率与微生物相对丰度之间的相关分析发现，瘤胃中Ruminococcus_1(R=0.621)、Ruminobacter(R=0.536)、Anaeroplasma(R=0.517)的相对丰度与氮利用率存在显著正相关关系;瘤胃中Succiniclasticum(R=-0.55)，真胃中Anaerovibrio(R=-0.548)，空肠中Candidatus_Saccharimonas(R=-0.75)、Ruminococcus_2(R=-0.546)和Tyzzerella_3(R=-0.568)，结肠中Lachnospiraceae_UCG-009(R=-0.750)和Blautia(R=-0.588)的相对丰度与氮利用率之间存在显著负相关关系;
　　(5)实时定量PCR结果表明，HNU组中Butyrivibrio_fibrisolvens（P=0.002）的拷贝数极显著高于LNU组，Fibrobacter_succinogenes（P=0.022）和Ruminococcus_sp._HUN007(P=0.014)的拷贝数显著高于LNU组，而Prevotella ruminicola、Streptococcus bovis、Succinivibrio dextrinisolvens和Ruminococcus flavefaciens的拷贝数在两组间没有显著差异。
　　综上所述，本研究发现山羊对饲料的氮利用率存在明显的个体差异;高、低氮利用率的山羊瘤胃，真胃，空肠，盲肠和结肠微生物的结构均存在显著的差异，其中瘤胃中微生物相对丰度在组间有显著差异的最多;不同胃肠段均存在与宿主对饲料氮利用率显著相关的微生物，其中瘤胃中最多;氮利用率越高，瘤胃中的Fibrobacter_succinogenes、Butyrivibrio_fibrisolvens、Ruminococcus_sp._HUN007等菌的拷贝数越高。

目录

声明

论文说明

摘要

符号说明

前言

第一章文献综述

1．粪尿氯的排放对环境的影响

1．2粪尿氮的排放对空气的危害

1．3粪尿氮的排放对水体的危害

1．4粪尿氯的排放对土壤的危害

2．提高反刍动物氮利用效率的研究

2．1反刍动物的氮代谢规律

2．2提高反刍动物氮利用率的措施

2．3提高反刍动物氮利用效率的研究现状

3．反刍动物的氮利用率与肠道微生物

3．2日粮氨的瘤胃后消化吸收与微生物

3．3氮素循环与微生物

3．4氮利用率相关的受体与微生物

4．存在的问题

5．研究目的、意义和主要内容

5．1研究目的

5．3主要内容

第二章试验研究饲料氮利用率不同的山羊胃肠道微生物的差异性研究

1．材料与方法

1．1试验动物和饲养管理

1．2试验设计

1．3样品采集

1．4指标的测定

1．5微生物总DNA的提取

1．6 PCR扩增及16S rRNA高通量测序

1．7生物信息学分析

1．8瘤胃中蛋白分解菌的实时定量PCR分析

1．9数据统计与分析

2．1羊只的氮利用率

2．2组间营养成分消化率的比较

2．3组间血液指标的差异分析

2．4组间瘤胃发酵指标的对比

2．5组间微生物高通量测序结果的对比

2．6胃肠道各部位组间菌群的差异性

2．7肠道微生物与氮利用率之间的相关性

2．8瘤胃中蛋白分解菌的组间差异

3．讨论

3．1羊只氮代谢率的个体差异

3．3影响山羊氮利用率的胃肠道微生物

第三章全文结论与创新点

附录

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间发表的学术论文