石蒜凝集素的纯化、性质及构象研究;单子叶石蒜科植物朱顶红和风雨花甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

摘要

该文对石蒜凝集素的研究主要包括纯化、性质、活性以及结构几个方面.石蒜(Lycoris radiata)球茎经匀浆、浸取、硫酸铵分级沉淀得到粗品,将粗品过阳离子交换柱(CM-Sepharose)、阴离子交换柱(DEAE-Sepharose)和SephacrylS-100分子筛层析得到凝集素纯品.经SDS-PAGE检测为单一蛋白带,亚基分子量为12KD,SephacrylS-100凝胶过滤测得其表观分子量为45KD,表明LRA是由四个相同亚基组成的蛋白.LRA能凝集兔血细胞和大肠杆菌,其凝集兔血细胞和大肠杆菌细胞的效价分别为0.95ug/mL和1.9ug/mL,对外周血淋巴细胞具有很强的促有丝分裂能力;糖抑制实验结果表明,甘露聚糖和甲状腺球蛋白能抑制LRA的凝血活性;对酵母细胞的凝集实验表明,LRA能凝集啤酒酵母细胞;在抗病毒活性方面,LRA能有效地降低II型人类单纯疱疹病毒(HSV-II)对Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)的感染,在500ug/mL时对正常Vero细胞无细胞毒性,IC<,50>=5~10ug/mL之间.在抗爱滋病病毒实验中,LRA能有效降低HIV-1和HIV-2对HT-4和CEM细胞的感染,LRA对HIV-1的半抑制浓度EC<,50>分别为0.43ug/mL和0.79ug/mL,对HIV-2的EC<,50>分别为0.60ug/mL和0.59ug/mL,而LRA对HT-4和CEM的半数细胞毒性浓度为71ug/mL,表明LRA是一种有效的抗病毒蛋白.研究了不同温度、pH和特异化学修饰后LRA的荧光光谱变化,发现温度的升高和pH的改变对荧光光谱影响不大,Tyr的修饰使荧光强度降低;丙烯酰胺、KI和氯化铯均能够使LRA的荧光淬灭,丙烯酰胺能淬灭93.6﹪色氨酸残基的荧光;用NEM做修饰剂测定LRA的可反应巯基数和总巯基数,发现LAR中不含巯基,用比色法测定LRA中Trp的含量为5.3﹪,用NBS修饰时,测得每分子LRA中含有12.4个Trp残基,即每个亚基约含3个Trp残基.

目录

第一部分石蒜凝集素的纯化、性质及构象研究

摘要

Abstract

1引言

2材料、仪器和试剂

3方法

3.1石蒜凝集素的分离纯化

3.2蛋白浓度的测定

3.3 LRA纯度鉴定

3.4 Sephacryl S-100分子筛层析测定表观分子量

3.5性质检测

3.6 LRA的圆二光谱学研究

3.7 LRA的荧光光谱

4结果与讨论

4.1石蒜的分离纯化

4.2 LRA纯度和分子量测定

4.3LRA的性质研究结果

4.4 LRA的圆二色谱

4.5 LRA的荧光色谱研究

5结论

第二部分单子叶石蒜科植物朱顶红和风雨花甘露糖结合凝集素基因的克隆及序列分析

摘要

Abstract

1.引言

2材料和方法

2.1实验材料

2.2方法

3结果与分析

3.1朱顶红风雨花总RNA的提取

3.2朱顶红风雨花凝集素cDNA基因的克隆

3.3朱顶红风雨花凝集素基因全长核苷酸序列分析及推导蛋白序列

3.4 AVA和ZGA前体蛋白推测的氨基酸序列的同源性分析

3.5 AVA和ZGA蛋白成熟肽氨基酸序列同源性分析

3.6 AVA和ZGA蛋白信号肽的氨基酸序列分析

3.7朱顶红风雨花凝集素蛋白的性质与结构的预测

4讨论

参考文献

综述 植物凝集素的分子生物学研究

1前言

2植物凝集素的分类

3植物凝集素的结构与生物学功能

4凝集素基因同源性及其表达

5凝集素基因的克隆

6凝集素的翻译后加工过程

7植物外源凝集素在植物基因工程研究中的应用

8结束语

参考文献.

研究生期间发表的论文

声明

致谢