纳米双相磷酸钙瓷用于组织工程支架材料的实验研究

摘要

由肿瘤切除、创伤和先天缺陷造成的骨缺损需要大量的移植骨修复，临床上自体和同种异体骨应用最多，都存在明显的供、受区并发症。人工替代品有生物陶瓷、聚合物、合金以及其复合材料等，其中羟基磷灰石(Hydroxyapatite，HA)和β-磷酸三钙(β-tricalciumphosphate，β-TCP)因具有良好的生物相容性和骨引导性能而得到广泛的研究。 本课题研究了纳米双相磷酸钙陶瓷(Biphasiccalciumphosphatenanocomposite，NanoBCP)的成分、物理性能和生物相容性，并探索其用于骨组织工程支架材料的可行性。 (1)采用四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室制备的NanoBCP支架材料，通过大体及透射电镜(Transmissionelectronmicroscopy，TEM)、扫描电镜(Scanningelectronmicroscopy，SEM)和X射线衍射(X-raydiffraction，XRD)观察材料表面结构，测定材料孔隙、矿物相组成、及抗折、抗压强度。发现NanoHA的粒晶大小为50-80nm，XRD发现其成分为HA和β-TCP，扫描电镜观察到其孔径100-400um,测量含孔率为60％-80％，抗折强度为4.6Mpa，抗压强度为8.5Mpa。支架的孔隙及物理性能特点符合骨组织工程支架材料的要求。 (2)为进一步体内试验提供理论依据，本研究将NanoBCP支架进行溶血试验、凝血试验、急性毒性试验及皮下植入试验来评价其生物相容性。实验结果表明：材料无溶血现象，不影响凝血功能。动物实验表明材料无毒性反应。皮下植入试验显示纤维组织能够长入材料内部，材料对肌肉无刺激，证明了NanoBCP支架具有良好的生物相容性。 (3)降解性能是骨组织工程支架材料的重要特性之一，本课题将NanoBCP支架材料植入SD大鼠(Sprague-Dawleyrats，SDrat)腿部肌袋内，以双相磷酸钙陶瓷(Biphasiccalciumphosphate，BCP)和HA植入作为对照。24w取材，测定材料降解率。结果表明NanoBCP的降解率明显大于BCP支架，而HA基本没有降解。 (4)为了解其体外细胞相容性。首先分离SD大鼠BMSCs,进行骨向诱导、扩增，经检测证实其已表达成骨细胞表型后，与多孔NanoBCP(实验组)及BCP支架材料(对照组)体外复合培养，通过相差显微镜和SEM观察比较实验组与对照组BMSCs在材料上的生长及生理功能表达情况；测定细胞碱性磷酸酶(Alkalinephosphatase，ALP)活性、骨钙素(Osteocalcin,OC)含量，采用流式细胞仪(Flowcytometry，FCM)检测细胞的凋亡及周期、倍体，比较细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性。结果证明BMSCs经体外诱导可形成钙结节，Ⅰ型胶原和ALP免疫组化结果阳性，两组材料上皆有细胞附着生长，相差显微镜和SEM观察发现BMSC在支架上黏附良好，FCM检测结果显示复合培养对BMSCs的细胞周期有影响，G0/G1期细胞细胞减少，而S期及G2/M期细胞增加并且细胞增殖指数(Proliferationindex，PI)增高。对照组凋亡细胞百分比大于实验组，实验组的ALP活性及OC合成量均高于对照组。研究结果表明实验组细胞的粘附能力、增殖活力及成骨活性均大于对照组。 (5)为了探讨细胞与支架的体外粘附性能、规律及体内回植试验提供理论依据及参数。本课题将经过骨向诱导、扩增后的SD大鼠BMSCs与多孔NanoBCP支架(实验组)及BCP支架材料(对照组)体外复合培养，经相差显微镜和SEM观察比较实验组与对照组BMSCs在支架表面的贴附数量和形态；不同浓度细胞悬液接种NanoBCP支架材料，四唑盐比色试验(MTT)了解适宜的接种浓度及单位体积的NanoBCP支架材料最多可粘附BMSCs数量。结果显示实验组的BMSCs贴附数量显著高于对照组(P＜0.05)，当接种浓度为2×106/ml时，NanoBCP支架材料最多可粘附BMSCs数量为3.2×107/cm3。 (6)本课题采用原位成骨和异位成骨二种方法进一步探讨细胞与NanoBCP支架的体内成骨能力，异位成骨采用裸鼠为实验动物。体外分离、扩增、骨向诱导后的BMSCs接种于NanoBCP及BCP支架。将支架/细胞复合物植入裸鼠背部皮下，单纯NanoBCP支架材料植入作为对照。植入后4、8w取材，通过大体、组织学观察评价成骨活性。RT-PCR检测Col-1和OCmRNA,结果显示BMSCs与NanoBCP复合后，材料表面和孔隙内有新生骨形成，部分区域有血管和多核巨细胞分布。Col-1mRNA及OCmRNA在NanoBCP/BMSCs组的表达强于在BCP/BMSCs组。表明了NanoBCP细胞支架的成骨性能优于BCP细胞支架及单纯NanoBCP支架。 (7)原位成骨采用SD大鼠为实验动物，在其颅骨上制成直径为8mm的颅骨全层极限骨缺损区。植入细胞复合支架材料，对照组仅在相同部位植入无细胞的NanoBCP。而空白对照组不植入任何材料实验，结果发现新形成的组织工程骨与颅骨融合，能够有效地修复颅骨缺损。综合以上研究，NanoBCP具有良好的生物相容性和体外细胞相容性，与BMSCs复合后能形成骨组织，有望成为一种理想的组织工程支架材料。

目录

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缩略语表

前 言

第一部分纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料物理特性的评价

实验一NanoBCP陶瓷支架材料成分测定、物理性能分析

第二部分纳米双相磷酸钙陶瓷支架生物相容性的研究

实验一NanoBCP陶瓷支架材料组织及血液相容性的实验研究

实验二NanoBCP陶瓷支架材料体外细胞相容性实验研究

实验三NanoBCP陶瓷支架材料体外粘附的实验研究

实验四NanoBCP陶瓷支架材料肌内降解性能实验研究

附图

第三部分纳米双相磷酸钙陶瓷支架材料成骨性能实验研究

实验一BMSCs复合NanoBCP陶瓷支架材料异位成骨性能的实验研究

实验二NanoBCP陶瓷支架材料用于组织工程支架修复大鼠颅骨缺损实验研究

附图

全文总结

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