双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞β-防御素-2基因表达及其信号转导机制

摘要

消化道中定植有大量菌群，消化道上皮细胞与这些菌群直接接触，是肠道粘膜免疫的第一道防线，其分泌的抗菌肽分子在维持肠道微生态平衡、抵抗病原菌感染中占有重要地位。人β-防御素-2(hBD-2)是一重要的抗菌肽分子，广泛表达于皮肤、呼吸道、消化道、泌尿生殖道等粘膜上皮细胞中，具有重要的抗感染功能。hBD-2具有诱导表达的特点，通常情况下肠道上皮细胞不表达hBD-2，但在受到致病因子刺激时，hBD-2的表达量迅速提高，进而发挥粘膜保护功能。 以往的研究显示病原菌如肠炎性沙门氏菌，侵袭性大肠杆菌等能够诱导人肠道上皮细胞hBD-2表达，但是益生菌与抗菌肽之间的关系还没有相关研究，而且hBD-2诱导表达的调控及其信号转导机制十分复杂，目前尚不完全清楚。双歧杆菌作为人体主要益生菌之一，参与了宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染过程。因此通过探讨双歧杆菌与hBD-2表达之间的关系，寻找诱导hBD-2基因表达的有效刺激因子，不仅能够通过提高粘膜局部hBD-2浓度而达到杀灭病原菌的目的，而且有助于在分子水平上揭示机体抗感染免疫防御机制。 本项研究目的是检测双歧杆菌对人肠腺上皮细胞hBD-2基因的激活作用并分离其活性组分，进一步探讨其受体及其胞内信号传导通路。 首先，我们研究了双歧杆菌对人肠腺上皮细胞hBD-2基因的激活作用并分离其活性组分。厌氧培养长双歧杆菌，采用超声破碎细胞、超速离心、蛋白萃取方法获得双歧杆菌胞壁蛋白质成份，分别利用活菌，热灭活全菌，全细胞壁组分和全细胞壁蛋白组分，刺激人肠腺上皮细胞Caco-2，应用逆转录聚合酶链反应(盯-PCR)法和Northern杂交检测到在正常培养条件下肠道上皮细胞无可见的hBD-2mRNA表达，但在双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激下均检测出显著的hBD-2mRNA表达；应用ELISA检测结果显示，在Caco-2细胞受到双歧杆菌菌体、细胞壁和胞壁蛋白刺激的上清中hBD-2蛋白显著升高，免疫组化表明hBD-2主要表达在细胞浆中，Western结果表明在刺激后的Caco-2细胞上清和细胞裂解蛋白中均检测到hBD-2的表达。利用分子筛方法分离细胞壁蛋白，依据分子量大小分为四组，其中一组分子量为35-65kDa细胞壁蛋白活性组分，具有较强的诱导hBD-2表达的作用。 其次，我们研究了双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠道上皮细胞hBD-2转录调控机制及其胞内信号转导通路。WesternBlot结果显示，双歧杆菌胞壁蛋白可使IкB-α发生降解，磷酸化的IкB-α增多，同时发现细胞核内p65表达量也明显增高，提示双歧杆菌胞壁蛋白可诱导人肠道上皮细胞核转录因子NF-кB的活化。为了进一步检测NF-кB在介导双歧杆菌胞壁蛋白诱导的人肠道上皮细胞hBD-2基因表达中的作用，依据hBD-2基因上游调控序列，我们构建了含有NF-кB结合位点的绿色荧光蛋白重组报告基因质粒pEGFP-1/-510hBD-2，并在它的基础上将NF-кB结合位点进行突变，构建包含突变NF-кB的突变重组质粒pEGFP-1/-510mhBD-2。将上述质粒转染Caco-2细胞，双歧杆菌胞壁蛋白刺激后，流式细胞术检测结果表明，与pEGFP-1/-510hBD-2组比较，转染了突变的pEGFP-1/-510mhBD-2组绿色荧光明显降低，表明NF-кB在双歧杆菌胞壁蛋白诱导hBD-2的表达调控中发挥重要作用。WesternBlot方法观察双歧杆菌胞壁蛋白刺激肠道上皮细胞后胞内MAPK通路的信号分子的动态变化，发现双歧杆菌胞壁蛋白可刺激细胞内MAPKs蛋白分子ERK1/2、p38MAPK和JNK发生磷酸化，证实MAPKs信号传导通路参与了双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠道上皮细胞hBD-2的表达。 由于Toll样受体(TLRs)在调节机体免疫反应中具有重要的作用，我们进一步探讨了TLR介导的信号通路与Caco-2细胞hBD-2刺激表达的关系。为了提高转基因效率和目的基因的表达，我们利用AdEasy系统成功构建了突变pAd-mTLR2及突变pAd-mMyD88腺病毒表达载体，将构建的突变重组腺病毒表达载体感染Caco-2细胞株后，可显著抑制双歧杆菌胞壁蛋白对细胞hBD-2的诱导效应。上述试验结果提示双歧杆菌胞壁蛋白可能以TLR2为其受体，通过MyD88依赖途径诱导了肠道上皮细胞hBD-2的表达。 最后，为了能够在蛋白水平检测hBD-2的表达，我们制备了人hBD-2多克隆抗体。利用原核表达质粒pGEX-1λT为载体，将hBD-2成熟肽cDNA片段克隆到载体中，获得原核表达质粒pGEX-1λT-hBD-2。大肠杆菌裂解物经亲合层析纯化后获得分子量约30kDa的融合蛋白GST-hBD-2，将此融合蛋白免疫新西兰大白兔，获得抗血清后，利用正辛酸－硫酸铵分步沉淀法初步纯化抗血清，ELISA法显示抗血清对hBD-2的效价为1：12800，Western印迹和免疫组化显示抗血清可识别hBD-2。为从蛋白质水平研究hBD-2基因的诱导表达、组织分布和基因调控等研究打下了基础。

目录

摘要

前言

第一部分双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞hBD-2基因表达

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

结果

1双歧杆菌的鉴定

2RNA提取

3RT-PCR检测Hbd-2 mRNA的表达

4Northern杂交检测Hbd-2mRNA的表达

5Western Blot检测检测hBD-2蛋白的表达

6免疫组化检测检测hBD-2蛋白的表达和分布

7双歧杆菌胞壁蛋白活性组分分离与检测

讨论

结论

第二部分双歧杆菌胞壁蛋白诱导人肠腺上皮细胞hBD-2基因表达调控及其信号转导机制研究

材料及方法

1实验材料

2方法

结果

讨论

结论

第三部分TLR-2受体信号通路在双歧杆菌胞壁蛋白诱导肠腺上皮细胞hBD-2表达中的作用

材料及方法

1材料

2方法

结果

1凝胶电泳初步筛选重组腺病毒质粒

2重组腺病毒质粒酶切鉴定1

2重组腺病毒质粒酶切鉴定2

讨论

结论

第四部分人抗菌肽hBD-2大肠杆菌原核表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

材料与方法

1实验材料

2实验方法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述一：胃肠道抗菌肽研究进展

文献综述二：Toll样受体及其信号转导

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