肝干细胞作为肝细胞癌靶向基因治疗载体的实验研究

摘要

研究目的：构建稳定表达外源标记基因的工程化肝干细胞，在体外共培养体系及动物体内移植实验中观察标记肝干细胞对肝癌细胞的定向趋向能力，初步探讨以肝干细胞作为肝细胞癌靶向基因治疗载体的可行性。 方法：1.采用细菌同源重组法构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因腺病毒载体pAd-CMV-EGFP，在人胚肾293细胞中包装制备腺病毒，并用重组腺病毒感染体外培养的大鼠肝干细胞WB-F344，观察腺病毒携带的外源基因EGFP在WB-F344细胞中的表达及对肝干细胞的感染效率。单克隆培养纯化建立稳定表达EGFP的细胞株(WB-EGFP)，并采用流式细胞术、免疫细胞化学技术、诱导分化实验以观察其生物学特性。2.利用重组腺病毒介导EGFP在大鼠肝干细胞WB-F344和原代培养的胚胎成纤维细胞中表达，建立工程化稳定表达EGFP的肝干细胞WB-EGFP、大鼠胚胎成纤维细胞REF-EGFP。在相互隔离的条件下，共培养肝癌细胞CBRH7919和肝干细胞WB-EGFP或成纤维细胞REF-EGFP，连续动态观察肝干细胞在共培养体系中迁移的生物学行为，以探讨肝干细胞是否有趋向肝癌细胞的特性。3.将肝癌细胞CBRH7919在免疫抑制的Wistar大鼠肝脏原位注射，建立大鼠肝癌原位动物模型，从尾静脉注射EGFP标记的肝干细胞，不同时点取大鼠肝癌、癌旁肝组织、正常肝组织、脾脏、肾脏以及肺脏组织标本，动态追踪肝干细胞在体内的迁移，并用免疫组织化学染色证实c-kit阳性细胞的分布。免疫组织化学染色法，分析SDF-1、c-kit在正常肝组织和肝癌组织中的表达差异。进一步，经门静脉、肝动脉、尾静脉、癌旁肝组织等四种不同的途径移植肝干细胞，观察分析不同移植途径对肝干细胞趋向肝癌及肝癌组织内定植、增殖能力的影响。 结果：1.成功构建腺病毒载体，包装制备出高滴度的重组腺病毒Ad-EGFP。重组腺病毒能有效感染肝干细胞WB-F344，感染率约40～70％。单克隆培养建立WB-EGFP细胞株，观察直观，连续传代8～9代均较稳定表达EGFP及肝干细胞表面标记，仍保持干细胞样的增殖、分化等基本生物学特性。2.成功建立稳定表达EGFP的大鼠肝干细胞(WB-EGFP)、胚胎成纤维细胞(REF-EGFP)。在肝干细胞与肝癌细胞共培养体系中，观察到隔离区细胞爬片上培养的WB-EGFP细胞缓慢向肝癌细胞CBRH7919生长区移动，不仅发生在中央隔离空白区接种的WB-EGFP细胞，而且最边缘空白区接种的WB-EGFP细胞也有类似的定向迁移；而胚胎成纤维细胞无趋向肝癌细胞迁移的现象，72小时后仍大部分停留在盖玻片上。两种细胞向肝癌细胞定向迁移的细胞数量有明显差异(P＜0.01)。3.建立大鼠肝癌模型，经尾静脉移植分子标记的肝干细胞，动态观察发现肝癌组织边缘出现明显的绿色荧光细胞环绕，荧光细胞逐渐扩散到肝癌组织中，甚至到达肿瘤中央区域。而癌旁肝组织、对照组正常肝脏、脾脏、肾脏以及肺脏中，均无明确的荧光细胞分布。免疫组化分析，肝癌组织中c-kit阳性细胞明显增多(P＜0.001)，SDF-1表达与正常肝组织比较无明显升高(P＞0.05)，肝干细胞这种定向远距离迁移至肿瘤的分子机理与趋化因子SDF-1的表达可能无确切相关关系。不同移植途径对肝干细胞的体内分布有影响，四种移植途径中，门静脉途径更有利于肝干细胞定向迁移至肝癌瘤床，并迅速在肿瘤组织中定植、增殖(P＜0.05)，部分替代并整和肿瘤组织。同时肝干细胞在体内仍稳定表达外源标记基因产物。 结论：利用重组腺病毒能有效地介导外源基因在肝干细胞中稳定表达，不影响其干细胞的生物学特性。肝干细胞可作为基因治疗的载体携带目的基因，同时标记的肝干细胞可用于体内外肝干细胞研究中的示踪、鉴定。肝干细胞在体内外实验中均表现出具有定向追踪肝癌细胞的能力，并可在肿瘤瘤床中定植、增殖，稳定地表达外源基因。因而，肝干细胞可望作为肝癌靶向基因治疗的载体细胞。

目录

声明

缩略词中英文对照

摘要

前 言

第一部分：腺病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠肝干细胞中的表达

摘要

前言

材料与方法

结 果

讨 论

结论

附 图

参考文献

第二部分：肝干细胞向肝癌细胞趋向性迁移的体外实验观察

摘要

前言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

第三部分：肝干细胞肿瘤趋向性的动物实验研究

摘要

前言

材料与方法

结 果

讨 论

结 论

附 图

参考文献

全文总结

文献综述 肝干细胞的研究进展

致 谢

攻读博士期间发表的论文