花生凝集素介导的结肠癌靶向给药系统的研究

摘要

结肠癌是胃肠道常见肿瘤。放疗对结肠癌敏感性较差及小肠毒副作用明显。常规化疗时，由于抗肿瘤药物通常缺乏区分正常细胞和恶性肿瘤细胞的选择性，容易引起全身的毒副作用、降低患者对治疗的耐受性。肿瘤靶向治疗有望将抗肿瘤药物选择性地集中在肿瘤组织，而没有临床上区域动脉灌注所带来的手术痛苦和风险，因而是较好的替代方法。目前，肿瘤靶向治疗最大的障碍是缺乏合适的具有特殊识别能力的药物载体。寻找选择性强、能够有效载带抗肿瘤药物的靶向载体，并考察其在体内的靶向性及在肿瘤模型中的活性，是靶向治疗研究中的热点领域。 近年来，凝集素在肿瘤研究中的应用受到了越来越广泛的关注。人体细胞膜含有丰富的糖蛋白和糖脂，其中糖类部分的单糖和寡糖可与凝集素发生特异性的亲和结合，不同细胞的受体由于所含糖的结构不同，只能与特定的凝集素结合，从而使凝集素具有“识别”某种细胞的能力。而且，某些肿瘤细胞存在着特异性的凝集素受体。此外，凝集素无免疫源性、与单糖及糖复合物中的糖结构部分的识别具有高度特异性、具有多价结合能力并且结合了某些药物、毒性蛋白、放射性同位素后其活性保持不变。因此，凝集素在肿瘤的靶向治疗中有着极好的应用前景。将抗肿瘤药物与凝集素偶联，选择合适的凝集素或许可以控制细胞对偶联物的摄取和其在细胞内的传递途径，从而实现肿瘤治疗真正意义上的细胞靶向。但目前，有关其在肿瘤靶向治疗中的作用的研究尚在起步阶段。 花生凝集素(PNA)是从花生中提取并纯化的一种蛋白质，具有如下主要特点：1)不凝集正常的淋巴细胞和血液细胞，如红细胞、白细胞；2)花生凝集素是种子植物的组成成分，亦是人常常食用的营养物质，无明显毒副作用；3)对酸性环境和多种酶有较好抗性；4)具有多价结合能力；5)结直肠肿瘤细胞上PNA受体与正常组织之间存在显著性差异，在大量癌变的结肠上皮细胞的细胞膜上和细胞的顶端胞浆内出现了PNA结合位点。以上特点说明PNA具有作为抗肿瘤药物载体用于肿瘤靶向治疗的可能性。 本课题选择治疗胃肠道肿瘤的一线药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)作为模型药物，以在胃肠道肿瘤有高表达受体的花生凝集素为靶向载体，通过EDC/NHS一步法制备出可口服给药的5-Fu-PNA前体偶联物。综合考察了该偶联物的制备工艺、特异单糖对凝集素生物活性的保护作用和体外稳定性以及偶联物的电泳性质。采用流式细胞仪和荧光显微镜，以人结肠癌细胞LoVo和人正常肝细胞Chang作为代表性细胞模型，通过模型细胞荧光强度的变化对偶联物的细胞作用机制进行探讨。并采用MTT法考察该偶联物的细胞毒性、特异性和选择性。从而在体外对PNA为载体的肿瘤细胞主动靶向给药系统的可行性进行系统评价。该研究未见报道。本研究将丰富靶向给药系统的研究内容和科学基础，为靶向给药系统的研究提供一个新的领域。 本研究首先进行了5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶联物(5-Fu-PNA)的制备研究。偶联反应时，如何保护蛋白质不变性，实现药物与凝集素载体的偶联，避免凝集素的自身交联，保留凝集素的生物活性同时得到较高的药物连接率，是本试验研究的重点和难点。采用蛋白质常用的修饰方法EDC法制备时，需要先进行羧基的活化，但由于5-Fu不含羧基，只有选择凝集素先进行活化。但凝集素本身也含有氨基基团，活化的同时就可能导致凝集素的自身交联，从而使得偶连物的载药量降低、生物活性丢失、后续的药效学药理学评价无法进行。因此，本试验选择了将5-Fu进行衍生化，得到了1-N-羧基取代5-Fu，并采用EDC/NHS法对1-N-羧基取代5-Fu进行活化，形成具有较高稳定性的活性酯。再采用D-半乳糖保护凝集素活性中心的方法，将活性酯与花生凝集素PNA连接，得到药物与载体的酰胺键共价偶联物。 以C57小鼠胸腺细胞凝集实验法检测偶连物生物活性，建立了TNBS法测定药物连接率。并以生物活性和药物连接率为指标考察了1-N-乙酸取代5-Fu、EDC与NHS三者摩尔比、12h和24h的连接反应时间、D-半乳糖(D-gal)加入量对偶连物连接的影响。结果表明，1-N-乙酸取代5-Fu、EDC与NHS三者摩尔比为1：5：2，连接反应时间为12h，D-半乳糖(D-gal)加入量为PNA的2.5倍以上时，可制得药物连接率38.42％、凝集活性完全保留的偶连物。达到了实验设计目的。此外，对偶连物的性质和体外稳定性也进行了考察。偶连物在SDS-PAGE图上出现了新的分子量增大约3kD的条带。4℃放置一个月以上，凝集活性基本不变，可保持在85％以上。偶连物在人工肠液、37℃条件下，6h以内活性不下降，可保持在95％以上。但在人工胃液、37℃条件下，5min时偶连物已经完全降解。因此，可考虑将偶连物制成供口服的结肠制剂。 采用流式细胞术和荧光显微镜对5-氟尿嘧啶-花生凝集素偶联物与靶细胞LoVo和非靶细胞Chang的结合特点与内化机理进行了探讨。结果表明，5-Fu-PNA可与靶细胞LoVo发生特异性粘附，可被花生凝集素特异的单糖抑制。这种特异性粘附具有浓度依赖性，低浓度时靶细胞的荧光强度低于高浓度时的荧光强度。这种特异性粘附还具有温度依赖性，4℃时靶细胞的荧光强度高于37℃时，提示偶连物可能被细胞内化进入胞内。与此相反，5-Fu-PNA几乎不能结合非靶细胞Chang。证实了凝集素介导的偶连物对目标细胞的主动识别和选择作用。 采用MTT试验法评价了偶连物的细胞毒作用及特点，主要包括：1)5-Fu-PNA对靶细胞LoVo的细胞毒作用与游离药物一样，呈浓度依赖性和时间依赖性；2)与游离药物相比，偶连物的作用时间滞后于游离药物。当5-Fu的浓度为8μM时，游离药物杀死全部细胞需要96h，而偶连物需要120h，提示5-Fu-PNA在体内可能具有缓释效果；3)无活性偶连物和游离PNA对靶细胞几乎不产生细胞毒作用。 表现为在60μg/ml的高浓度下、48h的作用时间时，无活性偶连物和游离PNA组细胞存活率维持在90％以上，而活性偶连物组细胞存活率仅为48.41％，提示偶连物的细胞毒作用是特异性的；4)与对靶细胞LoVo的细胞毒作用相反，5-Fu-PNA对非靶细胞几乎没有细胞毒作用，而游离药物对Chang细胞的作用与对LoVo细胞的作用是一致的。又一次证实了偶连物具有选择性识别靶细胞的能力，其细胞毒作用是选择性的。提示在体内给药时，偶连物可能选择性分布于靶部位、靶细胞，降低其它非靶部位的分布而减少毒副作用。

目录

前言

参考文献

第一部分 5-氟尿嘧啶—花生凝集素偶联物的制备

概述

实验方法和结果

一、主要试剂、设备与动物

二、方法与结果

二、方法与结果1.5-氟尿嘧啶衍生物：1-N-乙酸-5-氟尿嘧啶的合成

二、方法与结果2 PNA稳定性考察

二、方法与结果3.偶联物5-Fu-PNA的制备

二、方法与结果4.偶联物制备条件的优化

三、小结

参考文献

第二部分偶联物性质研究

概述

实验方法

一、主要试剂、设备与动物

二、实验方法与结果

三、讨论

四、结论

参考文献

第三部分偶连物与细胞的相互作用

概述

实验方法与结果

一、仪器、试剂与细胞系

二.方法与结果

二.方法与结果 1. 5-Fu-FITC-PNA复合物的制备与药物结合率的测定

二.方法与结果 2 LoVo和Chang细胞培养

二.方法与结果3偶连物与结肠癌细胞LoVo和正常人肝细胞Chang的相互作用

二.方法与结果4.讨论

三、结论

参考文献

第四部分5-Fu-PNA偶连物的细胞毒作用

概述

实验方法与结果

一、仪器、试剂与细胞系

二、方法与结果

二、方法与结果 1.LoVo生长曲线的测定

二、方法与结果 2.5-Fu和5-Fu-PNA对结肠癌细胞LoVo的细胞毒作用

二、方法与结果 3 5-Fu-PNA对LoVo细胞毒作用的特异性

二、方法与结果4.5-Fu-PNA细胞毒作用的选择性

三、结论

参考文献

全文结论

致 谢

植物凝集素的应用研究进展

参考文献

简 历

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