苍蝇群落演替及MtDNA分子标记的法医学研究

摘要

目的研究呼和浩特地区夏秋季常见嗜尸性苍蝇生态群落组成与演替；利用线粒体DNA(mtDNA)上细胞色素氧化酶辅酶Ⅰ和Ⅱ(COⅠ和COⅡ)以及16SrDNA中278bp和635bp以及513bp基因序列，鉴定嗜尸性苍蝇的种类，解决依据形态学方法不能鉴定苍蝇卵的种类、很难鉴定幼虫、蛹种类的难题，为法医鉴别嗜尸性苍蝇及其幼虫、蛹、卵种类提供依据。同时，探讨嗜尸性苍蝇mtDNA基因序列分析所得的遗传距离与所处地理纬度变化的相关与回归关系，为法医判断嗜尸性苍蝇所属地理种群，进一步准确鉴定其种类、推断死亡时间和地点创造条件。 方法连续两年用观察法研究7～10月份，家兔、狗尸体、鸡、鱼内脏等试验材料上的嗜尸性苍蝇生态群落组成与演替；随机采集放置在呼和浩特及成都地区室外草地家兔尸体上的嗜尸性苍蝇、幼虫、蛹、苍蝇腹中的卵。利用改进的小型昆虫DNA匀浆提取方法提取上述样本mtDNA；通过Perkin-Elmer9600扩增仪进行PCR扩增；琼脂糖水平电泳以及聚丙烯酰胺非变性凝胶连续缓冲体系垂直电泳和银染显色技术进行扩增结果检测；PCR胶回收试剂盒纯化；ABI377测序仪测序；DNAMAN4.0序列分析软件，进行序列比对，截取等长度片段；MEGA2.1软件包进行序列分析和构建系统发育树。同时，通过GenBank中BLAST检索系统检索世界性研究最为广泛的23个果蝇mtDNA上COⅠ中278bp基因序列，以及包括本试验组检测并上传的采集于呼和浩特和成都地区及世界其它地区的10个丝光绿蝇和10个铜绿蝇的mtDNA上COⅡ中的635bp基因序列；用MEGA2.1软件包进行序列分析和构建系统发育树，并将分析所得的各苍蝇间的遗传距离与地理纬度差运用SPSS统计软件进行回归和相关分析。 结果该地区上述尸体上出现的双翅目嗜尸性苍蝇3科8属10种，主要有蝇科的家蝇、开普黑蝇、刺足齿股蝇、厩腐蝇；丽蝇科的丝光绿蝇、大头金蝇、铜绿蝇、巨尾阿丽蝇；麻蝇科的棕尾别麻蝇、肥须亚麻蝇。上述嗜尸性苍蝇是最先到达尸体上的昆虫，而且在尸体上出现时间及部位表现出很强的生态群落演替规律性；mtDNA上COⅠ和COⅡ的两个片段，在双翅目嗜尸性苍蝇的种内进化分歧均数小于1％，种间进化分歧均数大于8％。然而，对于亲缘关系非常接近的铜绿蝇和丝光绿蝇来说，由于二者的种内、种间进化分歧均数非常相近，运用COⅠ和COⅡ两个片段则很难区别。但是，利用mtDNA上16SrDNA中513bp基因序列，可解决这一难题。在地理种群基因差异性研究方面，10个丝光绿蝇mtDNA上COⅡ中635bp基因序列分析所得遗传距离与地理纬度差之间有相关关系(R=0.286，P=0.034)。仅通过现有资料对23个果蝇(R=-0.005，P=0.939)、10个铜绿蝇(R=0.104，P=0.450)的遗传距离与地理纬度差之间相关关系尚不能完全确定，有待于进一步探讨。结论该地区生态群落演替规律性可以成为法医在呼和浩特地区对尸体进行死亡时间、死亡方式、死亡地点推断的依据；mtDNA上COⅠ和(或)COⅡ序列分析能有效地对绝大多数嗜尸性苍蝇进行种类鉴定。该检测方法快速、简便和精确，能作为法医鉴别嗜尸性苍蝇种类的可靠依据。16SrDNA上513bp基因序列分析也能有效地对嗜尸性蝇类进行种类鉴定，特别是解决了运用COⅠ和COⅡ两个片段很难区别铜绿蝇和丝光绿蝇的难题。该检测方法是对依据COⅠ和COⅡ序列分析方法鉴别嗜尸性苍蝇种类的完善和补充。在地理种群基因差异性研究方面，嗜尸性蝇类的遗传距离与地理纬度差之间的相关关系尚不能完全确定，有待于进一步探讨。

目录

引 言

摘 要

本文所用缩写中英文对照

第一编：呼和浩特地区夏秋季嗜尸性苍蝇群落组成与演替

前 言

1材料与方法

2结果

3讨论

4结论

参考文献

附照片1

附照片2

第二编：MtDNA分子标记在嗜尸性苍蝇种类鉴定中应用的研究

前 言

第一部MtDNA中COⅠ和COⅡ序列在嗜尸性苍蝇鉴定中的应用

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

附表

附图

第二部分16SrDNA序列分析在嗜尸性苍蝇鉴定中应用的研究

1材料与方法

2结果

3讨论

4小结

参考文献

附表

附图

第三部分嗜尸性苍蝇mtDNA基因序列分析与地理种群分布关系的研究

1研究对象

2结果

3讨论

4小结

参考文献

第二编结论

全文总结

综述（一）：法医昆虫学研究进展

一、法医昆虫学的定义和研究内容

二、法医昆虫学在实际案件中应用的主要理论依据

三、国内、外法医昆虫学的总体发展状况

四、尸体上昆虫生态群落演替的研究

五、昆虫发育形态学在法医昆虫学方面应用的研究

六、DNA分析技术在法医昆虫学方面的应用

七、法医昆虫毒理学方面的研究

参考文献

综述（二）：嗜尸性苍蝇线粒体DNA分子标记检测的研究

附 录一：

一、常见嗜尸性苍蝇标本的采集、保存与饲养

二、常见苍蝇生活史

三、常见嗜尸性苍蝇形态学特征以及地域分布

附图

附录二：

一苍蝇DNA的提取方法

二电泳及检测

三DNA测序

四紫外分光光度计定量DNA

五软件

附录三：

个人简历

一上传美国Genbank数据库的基因列表

二已发表和已定稿的第一作者文章列表

三申请基金资助课题情况

四曾获得的主要奖项

致 谢

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