人内皮抑素重组腺病毒转染人视网膜色素上皮细胞的体外实验

摘要

目的： 构建人内皮抑素重组腺病毒(Ad-ASP-hES)，并用其体外转染正常人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigmental epithelium，HRPE)，探讨转染后HRPE细胞的人内皮抑素(hES)表达情况，为内皮抑素抗视。网膜新生血管生成的基因治疗奠定基础。 方法： 1．利用Adeasy 1系统，构建Ad-ASP-hES。 2．体外培养正常HRPE细胞，角蛋白免疫细胞化学染色鉴定，观察细胞形态。 3．Ad-ASP-hES体外转染HRPE细胞，运用荧光显微镜观察转染效率。 4。逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)检测HRPE细胞中人内皮抑素mRNA的表达。 5.免疫组化染色检测转染后HRPE细胞hES的表达分布。 6．蛋白印迹法(Westernblot)检测转染后培养液上清中hES的表达。 结果： 1.重组腺病毒载体经PCR鉴定正确，病毒滴度为lxl0<'8>PFU/ml，表明成功构建了Ad-ASP-hES。 2．经角蛋白免疫细胞化学染色鉴定可见细胞浆内棕黄色的阳性反应，表明体外培养的细胞为正常HRPE细胞。 3．体外转染24h后，倒置荧光显微镜下观察，可见细胞中绿色荧光蛋白(green nuorescent protein，GFP)荧光，间接反映目的基因的表达，转染效率100％。 4．RT-PCR产物经琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，可见ASP-hES片段(623bp)的mRNA特异条带，符合设计的片段大小。对照组无表达。 5．免疫组化可见Ad-ASP-hES转染后，HRPE细胞浆内棕黄色的阳性反应，证实转染后视网膜色素上皮细胞产生人内皮抑素。对照组中细胞胞浆无染色。 6．Western blot法检测到Ad-ASP-hES转染24h后的培养上清液中有人内皮抑素蛋白表达，而对照组无表达。 结论： 本研究利用Adeasy 1系统，可以构建人内皮抑素重组腺病毒(Ad-ASP-hES)，并可转染体外培养HRPE细胞；转染后的HRPE细胞内有hES表达，并可分泌至细胞外。这些结果表明Ad-ASP-hES可以成为内皮抑素抗视网膜新生血管生成基因治疗的合适载体，而HRPE细胞是其靶细胞。

目录

论文说明：缩略词表

声明

前言

一、人内皮抑素重组腺病毒的构建及鉴定

二、HRPE细胞的培养与鉴定

三、人内皮抑素重组腺病毒体外转染HRPE细胞

讨论

展望

结论

参考文献

文献综述内皮抑素抑制血管生成的应用前景

致谢