组织工程化水平旋转生物反应器的研制

摘要

据一项调查表明，美国每年投资在有器官及组织损坏病人身上的资金高达4000多亿美元，几乎占了美国医疗费用的一半，每年约有800万次器官移植手术，约有4000人在等待器官移植时死亡，还有10万人未被列入等待器官移植时就已死亡。我国尚无确切的统计数据，但有关资料已显示在中等城市的医院，住院病人的数量占第一位的是创伤及中毒，发病率以每年7.5％速度递增。我国残疾人已达5500万人，其中肢体伤残者达755万人，无论何种损伤和残疾，均需要组织修复或功能重建。 当人体器官发生不可逆性病变，用其它所有疗法不能治愈，而预计短期内又无法避免死亡时，就可实施器官移植，而传统的器官移植有许多问题，供体严重不足，即使成功的移植后也存在长期的免疫治疗和昂贵的医疗费、人力护理代价等问题。因此，急需一种新型的技术和方法有效地解决人类病损组织和器官短缺问题。 组织工程（Tissue Engineering）是生物医学工程领域中一个快速发展的分支学科，是应用医学，材料学，工程学，化学和生物学原理和技术将细胞和生物材料创造成具有功能性组织的新兴领域，开发具有生物活性的组织替代物，修复受损组织。 旋转生物反应器是体外培养细胞或组织的新技术和新方法，是组织工程实现体外构建有功能的组织或器官的核心设备，使其最终成为生命机器具有重要的现实意义，经济价值和社会效益。因此，世界各国投入了大量的物力材力和精力开发研制各种生物反应器，极大地推动了相关领域的迅速发展，以美国NASA发明的RCCS系列的旋转生物反应器成为目前该领域最先进的产品之一，但其昂贵的价格严重地限制了在经济不发达的国家应用，尤其是那些急需而又无经济能力的研究机构的使用。在此背景下，我们研制了具有经济实用和简单等特色的通用型组织工程化水平旋转生物反应器。 方法 本研究主要分为以下5个部分进行： 1 水平旋转生物反应器的设计 在图纸上绘出水平旋转生物反应器各部分的结构，用手工操作车床加工316L不锈钢材料，先后经过棒料粗加工、高温回炉、精加工和抛光程序，完成旋转生物反应器的制作，对稳定性、无菌性、安全性、密封性能和材料性能进行测试。 2 水平旋转生物反应器的数值模拟 测量水平旋转生物反应器的几何尺寸，培养液的密度和粘度，用GRABIT划分反应器的结构网格，FLUENT6.0软件模拟培养室内部不同截面不同位置速度断面分布图，同样方法可以模拟压力的分布。 3 水平旋转生物反应器的力学环境 理论建模和微分方程求解，分析和计算水平旋转生物反应器内微重力状态和细胞所受剪应力的大小。 4 水平旋转生物反应器的质量传递 建立水平旋转生物反应器理想模型，在稳定状态下求出传质通量方程和浓度微分方程，分析营养物从培养液扩散到培养物表面以及从表面扩散到细胞内的传质过程，细胞生成的废物从细胞表面扩散到培养物表面，再扩散到培养液中的过程。 5 细胞在水平旋转生物反应器内的培养 分别用犬的骨髓间充质干细胞（canine mesenchymal stem cells，cMSCs）和EA.Hy926内皮细胞在生物反应器培养，同时和24孔板静态培养做对照，MODE0680酶标仪检测细胞的增殖、AVL-3血气分析仪分别测定动态组和静态组细胞培养液的pH值，氧分压P<,O<,2>>和二氧化碳分压P<,CO<,2>>，VITROS250全自动生化分析仪测定细胞培养液乳酸，AUS400全自动生化分析仪测定细胞培养液葡萄糖，JSM-5900L扫描电镜拍照。 结果 1 水平旋转生物反应器系统： 水平旋转生物反应器密封效果良好：转动稳定；重复性高，材料生物相容性较好；无毒无味；耐磨损；可用高压消毒。 2 水平旋转生物反应器内流速： 在转速为15rpm状态下，流速不是完全按照匀速圆周运动规律分布。 3 水平旋转生物反应器内压力： 在转速为15rpm稳定状态下，培养室压力分动压和静压两部分组成。动压分布不均匀：中心区域动压很小，靠近内壁动压较大，左下方和右上方动压最大，和静压相比可忽略不计。压力主要来源于静压，流体元在位置r（流体元距离培养室圆心的距离）时压力为：P=pgr［I-cos（ωt+φ）］。 4 水平旋转生物反应器内微重力： 当水平旋转生物反应器以某个速度匀速旋转时，培养室内的微重力环境用特征量K=ω<'2>r/go衡量，转速在5－50rpm范围内，K＜8.38×10<'-2>。 5 水平旋转生物反应器内剪应力： 水平旋转生物反应器以某个速度匀速旋转时，培养室内细胞所受到的最大剪应力为t=3μ/2ν/a。最大剪应力与培养液的粘度μ，培养液转动的线速度ν成正比，与颗粒（细胞种植在支架的复合物，简称为颗粒）半径a成反比。转速在5-50rpm范围内，剪应力＜1.62dyn/cm<'2>。 6 水平旋转生物反应器的物质传递： 在转速为15rpm稳定状态下，转动和压力是影响物质传递的关键因素，转动加强物质对流，压力主要来源于静压，距离培养室中心的位移为r的细胞所受到的压力为周期性函数，P=pgr［l-cos（ωt+φ）］，压力梯度增加，细胞吸收营养物能力增强，排泄废物能力下降；压力梯度减少，细胞排泄废物能力增强，吸收营养物能力下降。 7 细胞在反应器内培养结果： ①细胞增殖数量： MTT结果表明，细胞动态培养（在反应器）和静态（24孔板）培养，细胞增殖趋势基本一致，在培养时间内，cMSCs细胞数量一直处于上升状态，EA．Hy926内皮细胞数量在培养时间内呈现阶梯式增长。细胞增殖数量动态培养明显高于静态培养（24孔板）。 ②电镜结果 cMSCs细胞静态（24孔板）培养，细胞形态扁平细长瘦小，三维立体感差，分布稀疏不均匀，细胞外基质分泌少，伪足彼此连接少。细胞呈现梭形，球形和多角形。 EA．Hy926内皮细胞株静态（24孔板）培养，细胞形态扁平细长，三维立体感差，分布稀疏不均匀，细胞外基质分泌少，伪足彼此连接少。细胞呈现梭形，球形和多角形。 动态（在反应器内）培养，cMSCs细胞伪足与孔隙边缘或材料表面连接，黏附在复合材料上，分布连续均匀，细胞与细胞聚集成片，在材料上覆盖率较高，细胞丰满，三维立体感强，细胞外基质分泌旺盛并与材料边缘融合。 EA．Hy926细胞伪足或丝状伪足与孔隙边缘或材料表面连接，分布均匀，在材料上覆盖率较高，细胞形态丰满多样化，三维立体感强，细胞外基质分泌旺盛，有丰富的丝状伪足，表面伸出大量的绒毛状突起，这可能与低剪应力环境有关。 ③细胞代谢 动态（在反应器内）和静态（24孔板内）培养氧分压Po<,2>都随时间都在下降，但是动态比静态下降的幅度大速度快。动态培养pH值比静态的pH值偏低。动态和静态两种培养方式二氧化碳分压Pco<,2>都随时间在升高，在反应器内的二氧化碳分压明显比24孔板内的高。同样条件下在反应器内比24孔板内耗氧量大，排泄的二氧化碳积聚量多，说明动态（在反应器内）比静态培养（24孔板内）细胞生长旺盛，代谢快。 动态（在反应器内）和静态（24孔板内）培养，葡萄糖含量变化趋势基本一致，随时间的延续含量先升高再逐渐下降，但是926细胞在静态培养出现了反复上升和下降的趋势。不同细胞不同培养方式葡萄糖含量和乳酸含量达到高峰点时间先后不同以及高峰点的数值也不同；乳酸变化趋势基本一致，先上升然后下降，最后趋于平稳状态。但不同细胞乳酸含量高峰点出现的时间先后也不同。 结论 1自行设计研制的组织工程化水平旋转生物反应器可较好实现细胞三维立体培养，能作为较为理想的细胞组织培养先进装置。 2该种生物反应器结构简单，成本低，稳定性高，重复性好，耐磨损，操作简单易学，可长期在实验室使用，具有推广价值。

目录

论文说明：中英文缩略表

摘要

前言

第一部分水平旋转生物反应器的设计和评价

第二部分水平旋转生物反应器的数值模拟

第三部分水平旋转生物反应器的力学环境

第四部分水平旋转生物反应器的质量传递

第五部分水平旋转生物反应器在细胞培养方面的应用

附图

全文总结

组织工程化水平旋转生物反应器的研究进展

在读期间科研成果

致谢

声明