siRNA干扰Rac1基因表达及其抑制大鼠视网膜新生血管生成机制的研究

摘要

目的： 在眼部疾病中，血管增生过度是一大类致盲性眼病的根本原因，其中视网膜新生血管性疾病占据较大比例。视网膜新生血管的生长及其所致的出血、渗出、增生等是多种致盲眼病的主要病理过程。血管新生是多种分子共同作用的结果，而已往的研究多是针对单分子来控制血管新生，、这些方法虽然显示出一定抑制作用，但毕竟单分子作用是微弱的，故抗血管新生的作用也是有限的。近年来的研究表明Racl可能是调控多种血管生成相关因素的关键分子。为探讨Racl对于视网膜新生血管的调控作用，本研究采用RNA，干扰技术抑制Racl基因表达，观测其对视网膜新生血管生成及其相关生长因子表达的抑制作用。 方法： 1．第一部分Racl—siRNA表达载体构建 1.1以人Racl mRNA为模板，设计与大鼠同源的、针对Racl基因编码区的Racl—siRNA序列，并在体外转录合成。 1.2双酶切pSUPER质粒，与Racl—siRNA链连接，构建Racl—siRNA表达载体，转化感受态细胞(E.coli)后采用菌落PCR、双酶切(Bgl lI和HindⅢ)进行分离纯化，Sanger序列分析法进行载体鉴定。 1.3将构建的载体对HeLa细胞进行转染，观察各载体的转染效果。收集HeLa细胞进行RT—PCR，筛选出抑制效果较好的载体，抽提后进行动物实验。 2. 第二部分大鼠视网膜新生血管模型的建立 2.1视网膜新生血管模型建立：健康成年SD大鼠50只，常规麻醉后，尾静脉注射虎红，532nm激光光凝视网膜主要静脉，建立视网膜新生血管动物模型。 2.2光凝术后2周，采用心内注射FITC—dextran，视网膜铺片法观察新生血管生成的情况。 3. 第三部分Racl—siRNA抑制大鼠视网膜新生血管生成的体内实验 3.1大鼠玻璃体腔载体转染情况检测：玻璃体腔转染重组载体和空白载体后4天，行眼球冰冻切片。荧光显微镜下观察两种载体对活体视网膜组织的转染情况。 3.2采用50只成年SD大鼠，光动力法诱导视网膜静脉阻塞后，玻璃体腔转染Racl—siRNA载体作为基因干预组；另眼注射空白载体作为空白对照组；同时采用正常同龄大鼠25只单眼玻璃体腔内注射Racl—siRNA载体作为空白干预组。 3.3 2周后对3组动物进行心内灌注FITC—dextran，视网膜铺片，检测 视网膜新生血管生成情况。3.4取出3组大鼠眼球，常规石蜡包埋，矢状面连续切片，HE染色后显微镜下观测视网膜各层细胞的形态改变，计数突破内界膜的内皮细胞数，进行统计学分析。 3.5免疫组织化学法从蛋白水平检测各组大鼠视网膜内血管生成相关因子：Racl、VEGF、HIF-1α和NF-kB的表达情况。检测平均光密度值，进行统计学分析。 3.6提取各组大鼠视网膜总RNA，应用RT-PCR方法检测视网膜中血管生成因子：Racl、VEGF、HIF-1α和NF-kB的含量，进行数据归纳和统计学分析。 结果： 1. 第一部分，Racl-siRNA表达载体构建 1.1成功构建3种Racl-siRNA重组载体并进行了分离纯化，获得高度纯化的重组载体。载体序列鉴定验证所得载体序列与设计序列完全吻合。 1.2采用HeLa细胞对重组载体的转染效果进行初步检测。结果显示构建的3种重组载体对HeLa细胞的转染率都高达70％以上。 1.3收集HeLa细胞，提取RNA，进行RT-PCR，检测3种重组载体对Racl mRNA的抑制率。结果显示与空白载体相比，3种重组载体均有明显的抑制效果，其中载体1和载体2抑制效果较好。 1.4综合各方面条件，筛选转染率和抑制率较高的载体2，大量抽提后为下一步动物实验作准备。 2．第二部分大鼠视网膜新生血管模型的建立 2.1光凝手术时，可见视网膜静脉内明显黑色血栓形成，静脉粗细不均，远端静脉迂曲、扩张。 2．2光凝后第2天行眼底检查发现：视网膜主要静脉迂曲粗大、可见栓塞引起出血。 2.3 2周后FITC-dextran心内灌注视网膜铺片显示光凝眼与对照眼视 网膜血管形态：对照眼大鼠视网膜见深浅两层血管网，从视神经周围发出走向视网膜周边。浅层血管呈放射状分布，深层血管呈网状分布。光凝眼视网膜血管形态和分布发生明显改变，失去正常的放射状和网状结构，出现大量新生血管芽和新生血管枝，视网膜血管杂乱、纵横交错、荧光素渗漏。 3.第三部分Racl-siRNA抑制大鼠视网膜新生血管生成的体内实验 3.1转染4天后，各选取2只大鼠行眼球冰冻切片，于荧光显微镜下观察，可见视网膜区域呈现绿色荧光。从而证明重组载体和空白载体对活体视网膜组织的转染率都较高。 3．2光凝2周后FITC-dextran心内灌注视网膜铺片发现：空白对照组视网膜血管杂乱，纵横交错，产生大片状新生血管，大量荧光素渗漏。 基因干预组仅见小片状新生血管网，少量荧光素渗漏。空白干预组呈正常血管形态。 3.3基因干预组大鼠视网膜切片中，突破内界膜的血管内皮细胞平均数与空白对照组和空白干预组比较，两两间差异具有统计学意义(P<0.05)。 3．4视网膜免疫组织化学染色显示：基因干预组、空白对照组与空白干预组相比，视网膜中Racl、VEGF、HIF-1 α和NF－kB的表达较强，空白对照组最强。平均光密度值差异具有统计学意义(P<0.05)。 3.5 RT-PCR检测Racl、VEGF、HIF-1α和NF-<,к>B在基因干预组和空白对照组中与空白干预组相比表达较强。但基因干预组与空白对照组相比，上述4个因子表达下调，差异具有统计学意义(P<0.05)。 结论： 本研究表明：体外重组的Racl—siRNA表达载体能有效的抑制体内视网膜新生血管的生成，并且从蛋白水平、基因水平证明能下调多种视网膜内与血管生成相关生长因子的表达水平。其作用机制为：干扰RNA技术抑制Racl基因表达，从而抑制HIF—1α表达，阻断了血管新生相关生长因子的上游信号途径，下调了它们的表达，从而抑制新生血管生成。同期观察未见重组载体对视网膜有明显的毒副作用。本研究为视网膜新生血管性疾病的基因治疗方案，提供了新的可靠实验数据和理论依据。

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缩略词表

前言

第一部分Rac1-siRNA基因表达载体构建

第二部分大鼠视网膜新生血管模型的建立

第三部分Racl-siRNA抑制大鼠视网膜新生血管生成体内实验

文献综述RNA干扰与血管新生及其在眼科的研究进展

致谢