麻疯树（Jatropha curcas）花药培养及两个核糖体失活蛋白基因的表达研究

摘要

麻疯树(Jatropha curcas L.)系大戟科麻疯树属植物，具有显著的抗癌活性，在工业用油、生物病虫害防治、新药开发等方面也有着潜在的价值，并且又是干热河谷地区荒山造林的好树种，因此具有广泛的开发利用前景。 本实验对麻疯树的花药进行培养，从不同激素和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响作了初步研究。 克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin2基因，构建了curcin2基因的两种原核表达载体pET-C和pQE-C，并分别在Eccli B121和M15诱导表达，以比较curcin2基因的这两种原核表达系统的差异。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。 克隆麻疯树的核糖体失活蛋白curcin，定向克隆到植物双元表达载体pBI121质粒，获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将 curcin基因导入烟草。 1.对麻疯树花药愈伤组织诱导条件进行了优化，并对芽分化、根分化进行了初步研究，同时建立细胞悬浮培养体系。结果表明，愈伤组织诱导过程中，单核中晚期最适宜诱导，低温预处理以4℃3～5d为佳，培养基以MS+NAA2.0mg/L+KT0.4mg/L+9％蔗糖较好，最高诱导率为40.24％。芽分化培养基则仅MS+KT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+3％蔗糖能分化出芽，诱导率为11.67％。 暗培养条件下，1/2MS+IAA0.1mg/L 的培养基能诱导愈伤组织生根，但分化率很低，仅6.67％。 2.研究了不同激素组合和培养方式对花药愈伤组织中PPO和POD活性的影响。结果表明，固体培养过程中,PPO和POD活性都出现2次活性高峰，一次在3d，一次在21d(添加NAA的出现在24d)，分别与逆境和生长旺盛期相关，悬浮培养出现1次，在12d，出现在生长旺盛期；添加2,4-D和NAA的培养基培养的愈伤组织中，PPO和POD的活性要高于添加IBA和IAA的，添加KT的，活性要高于添加6-BA的；光照造成培养方式对PPO活性的影响要大于对POD的影响；在早期PPO和POD的活性都出现高峰，随时间的推移，活性都会下降，PPO的下降趋势远高于POD。 3.两个原核表达载体的构建：用根掘curcin2基因序列(GenBank登录号：AY435214)设计的扩增成熟肽编码区的特异性引物：P1：5'-GGATCC(BamH I)ATGGCTGGTTCCACTTT-3'； P2： 5'-GAGCTC(Sac I)ATACATT'GGAAAGATGAG GA-3'，以提取的麻疯树基因组DNA为模板进行PCR扩增，回收PCR产物并连接到pMD18-T载体，获重组子pMD-18T/curcin2，转化E.coli JM109。经测序以验证目的片段序列的正确性。用BamH I和Sac I对重组质粒pMD-18T/curcin和表达载体pET-32(c)、 pQE-30进行双酶切，回收目的片段，得到带互补粘性术端的curcin2基因片段(约930 bp)和pET-32(c)、pQE-30的线性表达载体。用T4 DNA连接酶将所得的目的片断分别与线形表达质粒pET-32(c)、pQE-30在16℃下连接，以构建重组表达载体pET-C和pQE-C。并将连接产物转入感受态的E. coli JM109，经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明目的片段curcin2 正确插入表达载体，成功构建原核表达载体pET-C和pQE-C。 4.两种重组菌的诱导表达：将含有重组子pET-C、pQE-C的E. coli JM109转化菌于37℃下扩大培养，并提取质粒。把重组质粒pET-C转入感受态的E coltBL21，重组质粒pQE-C转入感受态的E coli M15。经菌落PCR、双酶切及测序鉴定，证明成功获得转化子PCB和PCM。用不同的诱导温度，不同的诱导时间及不同的IPTG诱导浓度同时作用两种重组菌PCB和PCM。经SDS-PAGE和Western-blotting检测，结果表明，在任何诱导条件下，重组子PCB都没有curcin2重组蛋白产生，而PCM都能表达出curcin2的重组蛋白，但主要以包函体形式存在。在本实验设计的诱导条件下，PCM表达curcin2的优化条件为诱导温度16℃，IPTG浓度1mmol·L<'-1>，诱导时间16～24 h。在此基础上，进一步研究了curcin2原核表达产物在转化细胞中的存在形式。当诱导温度较低，诱导时间延长时有可溶性的curcin2产生。 5.利用PCR技术从麻疯树基因组中分离到编码麻疯树毒蛋白(curcin)的开放阅读框(ORF)。结果表明，curcin基因无内含子存在。该序列定向克隆到植物双元表达载体pBI 121质粒，获得植物表达载体pBI 121-curcin。通过根癌农杆菌和叶盘转化法将curcin基因导入烟草。在含卡那霉素的MS2(MS+6-BA0.1 mg/L+Kan 100 mg/L)培养基上诱导丛生芽，诱导率40％左右。丛生芽在形态上有90％是正常的。正常丛生芽在MS<,3>(MS+Kan 100 mg/L)培养基上诱导生根，生根率达到90％左右。最后将再生苗移栽到土壤中培养，成活率达95％。再生苗经过PCR检测证明15株中有13株整合了curcin基因。经过RT-PCR检测，有10株在转录水平上得到表达。转基因烟草对力枯丝核菌(Rhizoctonia solani)有一定程度的抗性。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录

声明

第一章麻疯树花药培养及愈伤组织中PPO、POD活性研究

1.材料与方法

1.1材料

1.2方法

2.结果与分析

2.1麻疯树花药愈伤组织诱导

2.2花药愈伤组织芽分化

2.3花药愈伤组织根分化

2.4悬浮培养体系的建立

2.5培养条件对愈伤组织中PPO和POD活性的影响

3.讨论

3.1花药培养几种重要的影响因素

3.2花药培养中的褐化现象

3.3悬浮培养体系的建立

3.4培养条件对愈伤组织中PPO活性的影响

3.5培养条件对愈伤组织中POD活性的影响

参考文献

第二章麻疯树核糖体失活蛋白基因curcin2的两个原核表达载体的构建

1材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 DNA的提取

2.2目的片段的PCR扩增

2.3原核表达载体pET-C和pQE-C的构建

2.4重组子的鉴定

3讨论

参考文献

第三章麻疯树核糖体失活蛋白基因curcin2的原核表达研究

1.材料和方法

1.1实验材料

1.2方法

2结果与分析

2.1转化子的鉴定

2.2 curcin2在两个原核表达系统中的诱导表达

3讨论

参考文献

第四章麻疯树核糖体失活蛋白基因curcin的真核表达研究

1.材料和方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果与分析

2.1 curcin基因的扩增

2.2表达载体的构建

2.3 Kan抗性植株的分化与形态观察

2.4转基因植株的鉴定

2.5转基因植株的移栽

2.6转基因植株抗病性分析

3讨论

参考文献

文献综述：植物花药培养及麻疯树核糖体失活蛋白的研究进展

第五章植物花药培养研究进展

1.植物花药培养概述

1.1花药培养的定义

1.2植物花药培养的意义

1.3植物花药培养程序

1.4植物花药培养的影响因素

2.植物花药培养目前存在的问题

第六章麻疯树核糖体失活蛋白的研究进展

1.研究史的回顾

2.核糖体失活蛋白的分类

3.核糖体失活蛋白的分布

4.植物核糖体失活蛋白的生物化学性质

5.核糖体失活蛋白的毒性

6.核糖体失活蛋白的作用机制

7.核糖体失活蛋白的酶学活性

7.1 RNA N-糖苷酶活性

7.2 RNA水解酶活性

7.3多核苷酸：腺苷糖苷酶活性

7.4对超螺旋环状DNA的酶活性

8核糖体失活蛋白的生物学活性

8.1核糖体失活蛋白的抗肿瘤作用

8.2核糖体失活蛋白的抗病毒活性

8.3核糖体失活蛋白对昆虫的作用

8.4核糖体失活蛋白对真菌的作用

8.5核糖体失活蛋白调节细胞代谢

9.核糖体失活蛋白的应用

9.1核糖体失活蛋白在农业上的应用

9.2核糖体失活蛋白在医学上的应用

10.总结与展望

参考文献

致谢

在读期间发表或待发表论文情况