CD147、MMP-2在人脑胶质瘤中的表达及CD147单抗抑制U251细胞侵袭性的实验研究

摘要

目的：基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)在恶性肿瘤侵袭与转移中发挥重要作用，而CD147作为．MMPs的诱导因子，可促进肿瘤及间质细胞表达MMPs。本研究旨在：(1)探讨CD147和MMP-2在人脑胶质瘤中的表达与肿瘤的级别、侵袭及预后的关系；(2)在体外试验中运用CD147基因工程单抗影响胶质瘤细胞表面CD147的表达，探讨其对肿瘤侵袭性的抑制作用及其作用机理。 方法： 1．标本来源：收集四川大学华西医院2001年至2004年间50例脑胶质瘤标本，男性28例，女性22例，年龄22～67岁，平均年龄48．2岁，根据WHO分类，胶质瘤Ⅰ　级5例，Ⅱ级18例，Ⅲ级9例，Ⅳ级18例，对照组10例为内减压术中切除的正常脑组织。体外实验采用人脑胶质母细胞瘤细胞株U251和鼠成纤维细胞株NIH3T3进行细胞培养。 2．主要试剂： CD147、MMP-2、MT1-MMP、MT2-MMP均为鼠抗人单克隆抗体、S-P免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒、CD147基因工程单克隆抗体。 3．方法：将胶质瘤和对照脑组织新鲜冰冻标本做RT-PCR对各级别CD147的mRNA进行半定量分析；并石蜡切片进行免疫组化染色，检测各级别胶质瘤和对照标本CD147和MMP-2的表达水平，结合随访资料进行预后分析。细胞培养分组：第一组成纤维细胞NIH3T3；第二组CDl47阳性表达人胶质母细胞瘤细胞株U251；第三组不同浓度U251+NIH3T3细胞。第四组：在不同浓度U251+NIH3T3细胞共同培养组中分别加入不同剂量的CD147基因工程单抗共同孵育以封闭细胞表面CD147分子表达，用明胶酶谱实验(Zymography)检测分析各组细胞及共同孵育组酶原型MMP-2及激活型MMP-2蛋白表达量，Western-blot检测各组细胞及共同孵育组CD1-47、MMP-2、MT1-MMP和MT2-MMP蛋白表达量，根据信号强弱分析蛋白表达量。以上资料均作统计学分析。 4．统计学方法：各组间计量资料的比较采用方差分析，两组间计数资料比较采用x<'2>检验，非参数秩和检验，Spearman等级相关性分析，检验水准为a=0.05(双侧)，所有数据分析均在SPSS12.0软件中完成。 结果： 1．免疫组化检测各级别胶质瘤标本中均有CD147和MMP-2的表达，RT-PCR检测到各级别胶质瘤标本中CD147 mRNA的表达，随着胶质瘤级别增高，CD147和MMP-2表达阳性率增高，CD147 mRNA表达水平也增高，对照组为弱表达或无表达，差异有统计学意义。 2．在细胞培养研究中，Zymography检测显示，在蓝色背景呈两条不同分子量的白色酶裂解明胶条带：酶原型MMP-2(68-kDa)和激活型MMP-2(62-kDa)，含有NIH3T3细胞的培养组均有两种条带显示，随细胞种类及浓度不同两种酶含量亦不相同，U251+NIH3T3细胞共同培养组中两种酶含量最高，随着U251细胞浓度的增高，激活型高于酶原型，单独U251细胞培养组两种酶含量呈弱表达或无表达。同时Western-blot检测显示，U251组CD147蛋白表达明显，酶原型MMP-2呈弱表达或无表达，NIH3T3组无CD147蛋白表达，酶原型MMP-2有表达，两种细胞共同培养组中酶原型MMP-2较强，两种细胞与CD147基因工程单抗共同孵育组酶原型MMP-2蛋白表达减弱，随着CD147基因工程单抗剂量增加酶原型MMP-2蛋白表达逐渐减弱，差异有统计学意义，提示CD147基因工程单抗对酶原型MMP-2蛋白表达量呈剂量依赖性抑制作用。Western-blot检测各实验组MT1-MMP和MT2-MMP蛋白的表达结果与酶原型MMP-2相似，且CD147基因工程单抗对MT1-MMP和MT2-MMP蛋白表达量也呈剂量依赖性抑制作用。 结论：CD147和MMP-2在人脑胶质瘤侵袭性生长过程中起重要作用，在人脑胶质瘤中CD147和MMP-2呈高表达，且随级别增高而增强，在高级别胶质瘤中表达最强。在体外实验中，己1251+NIH3T3细胞共同培养组中U251细胞表达的CD147刺激成纤维细胞产生MMP-2和膜型MMPs(MT1-MMP和MT2-MMP)，MT1-MMP和MT2-MMP作为MMP-12的激活因子可激活酶原型MMP-2；CD147基因工程单抗可以抑制U251细胞CD147的表达和生物学活性，从而抑制MMP-2、MT1-MMP和MT2-MMP的分泌，使肿瘤侵袭生长受到抑制。CD147和MMP-2表达水平可作为胶质瘤患者判断临床预后和制定诊疗计划有意义的参考指标，为脑胶质瘤靶向治疗提供新的思路。

目录

论文说明：缩略词表

声明

摘要

前言

第一部分CD147和MMP-2在人脑胶质瘤中的表达

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

第二部分CD147基因工程单抗抑制U251胶质瘤细胞侵袭性的实验研究

材料与方法

结果

讨论

小结

全文总结

参考文献

综述一CD147/EMMPRIN与脑胶质瘤关系的研究进展

综述二CD147结构，功能及治疗作用研究进展

致谢

攻读博士期间发表论文