应用组织工程技术构建复合层兔角膜组织的实验研究

摘要

目的:角膜病变是导致失明的常见原因,目前临床上唯一可靠、有效的治疗方法是角膜移植.角膜供体来源缺乏和免疫排斥反应是限制角膜移植手术开展的两大难题.组织工程技术的兴起和发展为解决上述问题提供了一条可行的新途径.组织工程化角膜的研究,开展至今已取得了长足的进步.从以往的体外单层组织构建的基础上,正逐渐向三维体系的多层结构深入.种子细胞来源的研究也日益受到关注.该课题以角膜缘上皮干细胞和角膜基质细胞为研究基础,应用组织工程学的技术方法,结合以往的研究成果,寻找一种构建复合层角膜组织的有效方法.方法:1)角膜缘上皮干细胞的培养、扩增及鉴定沿兔角膜缘上侧于显微镜下分离切取1×4mm角膜缘上皮组织,消化法获得角膜缘上皮细胞,接种于丝裂霉素处理过的3T3饲养层细胞上培养及扩增.观察克隆形成情况及细胞形态以及超微结构;进行克隆分析及克隆形成率的测定;用免疫组化及免疫荧光的方法检测角蛋白K3、p63、PCNA等角膜上皮干细胞及成熟细胞特异性标记物的表达;用Western Blotting的方法,从蛋白水平检测各标记物的表达情况.应用端粒酶活性检测法比较角膜缘上皮干细胞与中央上皮细胞的端粒酶活性.2)角膜基质细胞培养扩增及检测手术显微镜下解剖分离角膜基质组织,酶消化法获得细胞,体外培养,胰酶消化传代扩增,由光镜对各代细胞的形态学变化进行观测.3)角膜基质细胞-PGA复合物的体外构建及复合层角膜组织的体外构建.4)裸鼠皮下构建角膜基质组织后,体外继续接种上皮层的复合层角膜组织构建.结论:体外分离培养角膜缘上皮干细胞和角膜基质细胞体外增殖能力旺盛,可作为组织工程化复层角膜的种子细胞;应用组织工程技术在体外环境中可初步构建出与正常角膜结构类似的复合层角膜组织.

目录

英文缩略词表

引言

第一部分角膜缘上皮干细胞的培养、扩增及鉴定

前言

技术路线

材料与方法

结果

讨论

第二部分角膜基质细胞培养扩增及检测

第三部分组织工程化复合层角膜组织体外及裸鼠皮下构建

结论

参考文献

致谢

硕士研究生期间已发表的文章

综述 应用组织工程技术构建角膜组织的研究新进展