草鱼转录因子Runx1和Runx3的分离鉴定及其免疫功能研究

摘要

Runt相关转录因子（Runt-related transcription factor，Runx）是一个转录因子家族。哺乳动物Runx家族包含3个成员：Runxl、Runx2和Runx3，它们在多种生理活动中发挥了重要调节作用。其中Runx1和Runx3在免疫系统中的功能更令人关注，主要参与调节免疫细胞的增殖、分化和功能等。目前，虽然斑马鱼和河鲀的Runx家族成员及其辅助因子 CBFβ已被克隆和鉴定，但是 Runx1和 Runx3在鱼类的免疫学功能还未知。本论文以草鱼为研究模型，首先鉴定了Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征，然后提供它们参与免疫反应的证据，最后阐明它们的免疫调节功能，特别是在介导转化生长因子β（Transforming growth factor-β，TGF-β)调节作用中的地位。研究内容如下：
　　1.草鱼Runx1和Runx3的分离鉴定和诱导表达分析：（1）通过简并PCR和RACE PCR等多次PCR反应，克隆获得草鱼Runx1五种剪接体（Runx1 v1-5）和Runx3的cDNA序列。结构特征分析、氨基酸多序列比对及系统进化树分析证明它们分别是哺乳动物的Runx1和Runx3的同源基因。（2）Runx1的五种剪接体中， Runx1 v1-3具有完整的功能结构域，包括转录活化结构域（transactivation domain， TAD)、抑制结构域（inhibitory domain，ID)、PY模体及C末端VWRPY模体，而Runx1 v4-5缺乏TAD、ID、PY及VWRPY等功能结构域。组织分布检测发现Runx1 v1-3和Runx1 v4-5具有相似的组织分布特征，在胸腺中表达水平最高，其次是脾、肾、头肾等组织，在外周血白细胞中表达较高；Runx3在胸腺和脾中表达水平最高，其次是外周血白细胞。（3）LPS和PHA均能刺激草鱼外周血白细胞Runx1 v1-3、Runx1 v4-5和Runx3基因表达上调，而poly I:C只对Runx1 v1-3和Runx3有诱导作用。（4）嗜水气单胞杆菌感染促使草鱼Runx1 v1-3和Runx3在头肾、脾及胸腺组织中的表达不同程度增强，而Runx1 v4-5的表达上调仅发生在脾和胸腺组织。Runx1 v1-3和Runx1 v4-5在体内外免疫刺激实验中呈现出不同的时间动力学特征，说明它们的免疫功能可能存在差异；推测Runx1 v4-5可能作为一种天然存在的抑制剂，调控硬骨鱼Runx1信号通路中过度的激活反应。
　　2.草鱼Runx辅助因子CBFβ的分离鉴定和表达特征：（1）通过多种PCR技术，分离获得草鱼 CBFβ的cDNA序列；氨基酸多序列比对及系统进化树分析证明它是哺乳动物CBFβ的同源基因。（2）3D同源建模表明草鱼CBFβ的空间结构与哺乳动物CBFβ的空间结构相似度极高；CBFβ在结构上的高度保守性暗示了其在进化过程中的功能保守性。（3）CBFβ和Runx1、Runx3具有相似的组织分布特征，在胸腺中表达水平最高，其次是脾、头肾，在外周血白细胞中表达较高。（4） CBFβ主要定位于细胞核，证明了其作为转录因子发挥功能的基本特性。（5）LPS、PHA和poly I:C均能刺激草鱼外周血白细胞CBFβ基因表达上调。（6）嗜水气单胞杆菌感染草鱼后，CBFβ基因在头肾、脾和胸腺组织中表达水平上调，进一步确证CBFβ参与了硬骨鱼免疫反应。
　　3.草鱼Runx1和Runx3的功能鉴定：（1）Runx1五种剪接体和Runx3无需刺激，即能够直接入核，证明它们作为转录因子发挥功能的基本特性。（2）进一步探讨草鱼Runx1和Runx3对T细胞亚型的标志细胞因子和转录因子表达的影响。采用Runx1抑制剂的研究发现：草鱼外周血白细胞中LPS、PHA和poly I:C诱导草鱼细胞因子 IFN-?、IL-17A/F1和 IL-17A/F2基因的表达，这些刺激作用被阻断Runx1信号所抑制。但阻断Runx1信号并不影响poly I:C对转录因子Foxp3表达的上调。（3）由于没有特异的Runx3抑制剂，采用过表达草鱼Runx3方法的结果显示：在草鱼肾细胞系（Grass carp kindney cell lines，CIK）中，过表达草鱼Runx3上调转录因子T-bet的表达，而抑制转录因子GATA3的表达，但过表达Runx3或/和CBFβ对Foxp3的基因表达水平无影响。（4）研究草鱼Runx1、Runx3和辅助因子CBFβ的相互作用关系，结果显示：草鱼Runx1和Runx3之间并无相互作用关系，但过表达Runx1的两种代表性剪接体和Runx3均显著诱导CBFβ基因的表达，提示CBFβ可能参与Runx1和Runx3的调节作用。但是过表达的CBFβ并没有协同 Runx3的作用，可能因为内源性的CBFβ足以满足 Runx3发挥功能，或者Runx3-CBFβ的协同作用还需要其它转录因子的参与。
　　4.草鱼TGF-β免疫调节作用中Runx1和Runx3的表达和功能研究：（1）在草鱼外周血白细胞中，重组的草鱼TGF-β1上调草鱼CBFβ基因的表达，而对Runx1 v1-3和 Runx1 v4-5基因的表达存在先上调再下调的双重调节作用，提示它们在TGF-β的免疫调节作用中不同的诱导表达特征。（2）特别地，与诱导CBFβ和Runx1表达比较，TGF-β1更显著提高Runx3的mRNA水平。为强化该结果，本研究还检测了草鱼 TGF-β1对 Runx3蛋白表达的影响，为此首先制备和鉴定草鱼 Runx3多克隆抗体。WB分析显示Runx3多克隆抗体能识别分子量约为49 KDa的Runx3重组蛋白和外周血白细胞中的内源性Runx3蛋白（分子量约为46 KDa），证明了该抗体的有效性。采用该抗体的WB的结果显示TGF-β1刺激Runx3的蛋白高表达，说明Runx3可能是Runx家族中TGF-β1作用的主要成员。（3）为检验Runx1和 Runx3参与 TGF-β调节作用的假设，在外周血白细胞中研究在 TGF-β1抑制c-Myc表达过程中Runx1和Runx3的功能。具体地，抑制Runx1信号放大了TGF-β1对c-Myc的抑制作用，提示Runx1可能是TGF-β1调节c-Myc表达的负调控因素。相反地，过表达Runx3反而放大TGF-β1对c-Myc表达的抑制作用，提示Runx3可能促进了TGF-β1的该调节作用。为明确Runx3的上述功能，进一步构建Runx3显性失活质粒，在CIK中过表达该质粒后c-Myc的表达明显上调，但TGF-β1能够抑制该刺激作用。结合上述（2）的结果，即TGF-β1明显刺激Runx3的产生，这些结果提示TGF-β1可能通过诱导Runx3的产生来抑制c-Myc的表达。但Runx1和Runx3在TGF-β1调节c-Myc表达中发挥不同功能的机制有待研究。（4）进一步，在外周血白细胞中研究在 TGF-β1调节炎症相关新分子 nIL-1F表达过程中Runx1和Runx3的功能。结果显示TGF-β1抑制nIL-1F的表达，但Runx1和Runx3均没有参与TGF-β1的该抑制作用，提示Runx1和Runx3并没有参与TGF-β1的所有调节活动。
　　总之，本论文在阐明草鱼Runx1、Runx3及CBFβ的分子特征基础上，提供它们参与了鱼类免疫反应的证据，首次诠释了鱼类Runx1和Runx3的免疫调节功能，特别揭示了它们在TGF-β1免疫调节作用中的地位，从而增加了基于转录因子调控的鱼类免疫学知识。

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第一章 绪论

1.1 哺乳动物Runx家族成员及其免疫功能

1.2 哺乳动物Runx与TGF-β调节作用的关系

1.3 硬骨鱼Runx相关转录因子的研究进展

1.4 本论文的研究思路和结构组成

第二章 实验材料与方法

2.1 实验动物

2.2 细胞培养

2.3 体外细菌感染实验

2.4 基因克隆

2.5 基因mRNA表达水平的检测

2.6 蛋白表达载体的构建

2.7 细胞的瞬时转染

2.8 转录因子的亚细胞定位

2.9 蛋白表达水平的检测

2.10 多克隆抗体的制备与特异性验证

2.11 生物信息学分析

2.12 数据统计与分析

第三章 草鱼Runx1和Runx3的分离鉴定和诱导表达分析

3.1 概述

3.2材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 本章小结

第四章 草鱼Runx辅助因子CBFβ的分离鉴定和表达特征

4.1 概述

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 本章小结

第五章 草鱼Runx1和Runx3的功能鉴定

5.1 概述

5.2 材料与方法

5.3 结果

5.4 讨论

5.5 本章小结

第六章 草鱼TGF-β免疫调节作用中Runx1和Runx3的表达和功能研究

6.1 概述

6.2材料与方法

6.3 结果

6.4 讨论

6.5 本章小结

第七章 结论与展望

致谢

参考文献

附录

攻读博士学位期间取得的成果