转基因骨髓间充质干细胞移植修复成年大鼠脊髓损伤

摘要

本课题自大鼠骨髓分离培养间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，构建了分别携带脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophicfactor，BDNF)及神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)基因的真核表达质粒，经阳离子脂质体介导转染MSCs，G418筛选获稳定表达目的基因的细胞株，之后移植修复成年大鼠脊髓完全横断伤。 主要研究结果有： 1．自成年大鼠骨髓分离单个核细胞，经连续传代培养后，行克隆培养及成骨和成脂肪诱导分化，发现克隆培养的上述细胞大多数可以形成典型的细胞克隆，经成骨诱导后有钙结节沉积，经成脂肪诱导后细胞内出现脂肪滴，证实获得骨髓来源的间充质干细胞； 2．利用优化的成神经元诱导体系，诱导细胞获得典型的神经元样外观，维持培养1周后，70％以上的细胞呈现MAP-2(microtubuleassociated protein-2，微管相关蛋白-2)免疫反应阳性； 3．脊髓半横断后局部移植Hoechst标记MSCs，2月后切片观察，可见注射点周围密集的Hoechst标记细胞存活，细胞迁移主要沿脊髓纵轴方向、并跨过损伤区，迁移距离超过0.5cm，同时可见少量细胞沿水平方向迁移到注射点周围远隔部位，免疫组化染色显示少量(少于10％)存活细胞表达神经元及神经胶质细胞标记物； 4．脊髓半横断后不同时间点，经尾静脉注射移植MSCs，发现在脊髓损伤后1月内移植者移植细胞可在脊髓损伤部位明显聚集并良好存活，损伤5周时移植则局部细胞明显减少，而6周时移植则基本观察不到移植细胞的聚集现象，提示脊髓损伤后在一定时间窗内经血移植MSCs治疗在理论上是成立的； 5．大鼠脊髓完全横断伤后局部微注射移植MSCs、BDINF转染MSCs、NT-3转染MSCs以及BDNF转染MSCs+NT-3转染MSCs，结果显示单纯MSCs移植可在一定程度上促进神经再生及运动功能恢复，经BDNF或NT-3基因修饰后可改善上述治疗作用，而同时进行BDNF、NT-3两种基因修饰，可进一步提高治疗效果。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分大鼠MSCs分离培养、鉴定及成神经元诱导分化

第二部分异体MSCs脊髓内移植后的存活、迁移及分化

实验一损伤脊髓内MSCs微注射后的存活、迁移及分化

实验二大鼠脊髓损伤后不同时间经血移植异体MSCs的观察

第三部分GFP-BDNF、RFP-NT3重组质粒构建及转染MSCs

第四部分MSCs及转基因MSCs移植修复成年大鼠脊髓损伤

结论

参考文献

综述:细胞及组织移植治疗脊髓损伤的基础及临床进展

攻读学位期间发表及被接受的论文

致谢