上皮间充质转换过程中肿瘤细胞力学特性变化规律及其机制研究

摘要

肿瘤转移是肿瘤细胞从原发部位经淋巴道，血管或体腔等途径，到达其他部位继续生长的过程，肿瘤转移是肿瘤治疗失败的最主要原因。肿瘤转移过程中，肿瘤细胞会发生转移、侵袭以及粘附等过程，这些过程都是以肿瘤细胞的运动和变形为基础的，而肿瘤细胞的运动和变形能力与肿瘤细胞的力学特性紧密相关，肿瘤细胞力学特性主要包括肿瘤细胞刚度和肿瘤细胞粘性。研究表明，上皮间充质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）与肿瘤转移密切相关。肿瘤细胞发生EMT后，肿瘤细胞的迁移能力、侵袭能力以及形成转移灶的能力都获得了极大的增强。本文主要探究了EMT进程中肿瘤细胞力学特性变化规律及其初步调控机制，相关研究成果有望为肿瘤治疗提供新思路。 在本研究中人乳腺癌细胞先使用10ng/mL的TGF-β1处理48h来诱导其发生EMT，然后探究EMT进程中肿瘤细胞力学特性的变化规律及其调控机制。在该研究中，用10ng/mL的TGF-β1处理肿瘤细胞，探究不同处理时间后（0h，12h，24h，48h），肿瘤细胞形态、EMT标志蛋白、肿瘤细胞迁移以及侵袭能力的变化。首先，通过倒置显微镜观察发现药物处理48h过程中，肿瘤细胞形态逐渐变纤长，统计上皮样因子(Elliptical Factor,EF)同样发现在药物处理48h过程中，肿瘤细胞变纤长。接下来又通过共聚焦显微镜、Western Blot探究了药物处理肿瘤细胞后，EMT标志蛋白的变化。实验发现在药物诱导过程中Vimentin逐渐增多，E-cadherin逐渐减少。然后通过划痕实验、Transwell小室实验分别探究了肿瘤细胞迁移以及侵袭能力，发现肿瘤细胞迁移和侵袭能力显著增加。接下来，通过原子力显微镜探究了在诱导肿瘤细胞发生EMT进程中肿瘤细胞刚度的变化，结果表明在这个过程中肿瘤细胞刚度显著降低。大量研究表明，肿瘤细胞刚度主要是由肌动蛋白骨架决定。因此诱导肿瘤细胞发生EMT过程中肿瘤细胞肌动蛋白骨架的变化值得进一步探究。我们通过Western Blot以及流式细胞术发现，在肿瘤细胞EMT进程中肌动蛋白骨架发生了解聚，G/F-actin比值降低。这就说明EMT进程中，肿瘤细胞刚度降低是细胞肌动蛋白骨架解聚引起的。针对这一情况，本研究对于诱导肿瘤细胞发生EMT的进程中，肿瘤细胞刚度降低这一分子机制进行了探究。 大量的临床数据表明，高表达YAP以及Arhgap28的黑色素瘤患者生存率很低。通过qPCR实验发现在诱导肿瘤细胞发生EMT进程中，YAP以及Arhgap28在mRNA水平上显著增加，同时RhoA-Limk-Cofilin信号通路也受到了显著影响。使用sh-RNA沉默YAP后发现，肿瘤细胞刚度、G/F-actin显著增降低，同时RhoA活化以及cofilin的磷酸化也得到了促进。这就说明YAP可以通过RhoA-Limk-Cofilin信号通路调控肿瘤细胞骨架进而影响肿瘤细胞刚度。使用sh-RNA沉默Arhgap28后，G/F-actin显著增加，同时RhoA活化以及cofilin的磷酸化也得到了促进。这就说明，Arhgap28可以通过RhoA-Limk-Cofilin信号通路调控肿瘤细胞骨架进而影响肿瘤细胞刚度。当YAP被沉默后，通过qPCR以及Western Blot发现，Arhgap28在mRNA水平显著降低，其蛋白水平也显著降低。然而当Arhgap28被沉默后，YAP的表达并没有发生显著变化。以上结果就说明在诱导肿瘤细胞发生EMT进程中，YAP可以通过调控Arhgap28进而调控RhoA-Limk-Cofilin信号通路从而降低肿瘤细胞刚度。

目录

声明

第一章 绪论

1.1 研究背景与意义

1.2 国内外研究现状

1.2.1 上皮间充质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）

1.2.2 细胞刚度与细胞骨架

1.2.3 原子力显微镜测量细胞刚度的原理

1.2.4 YAP与肿瘤发生发展

1.2.5 Arhgap28与肿瘤的发生发展

第二章 EMT进程中细胞力学特性的变化规律

2.1.1 细胞

2.1.2实验仪器

2.1.3 实验试剂及溶液配制

2.2 实验方法

2.2.1 TGF-β1的使用以及储存

2.2.2 细胞培养

2.2.3 免疫荧光染色

2.2.4蛋白免疫印迹（Western Blot）

2.2.5划痕实验

2.2.6 Transwell小室实验

2.2.7原子力显微镜

2.2.8流式细胞术

2.2.9测定F/G-actin比率

2. 2.910软件及统计分析

2.3.1 TGF-β1处理细胞诱导发生EMT

2.3.2 TGF-β1诱导细胞发生EMT后细胞迁移和侵袭能力的变化

2.3.3 TGF-β1诱导细胞发生EMT进程中细胞刚度的变化

2.3.3 TGF-β1诱导细胞发生EMT进程中细胞骨架的变化

2.4 讨论

2.5 本章小结

第三章 EMT进程中调控细胞刚度变化的机制

3.1 引言

3.2.1 细胞

3.2.2 质粒

3.2.3 引物序列

3.2.4 实验仪器

3.2.5 实验试剂

3.3 实验方法

3.3.1 RT-PCR

3.3.2 细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提

3.3.3蛋白免疫印迹（Western Blot）

3.3.5细胞转染

3.3.6 划痕实验

3.3.7 侵袭实验

3.3.8流式细胞术

3.3.9测定F/G-actin比率

3.3.10原子力显微镜

3.4 实验结果

3.4.1 EMT进程中YAP表达发生变化

3.4.2 YAP能够调控细胞的转移、侵袭以及细胞刚度

3.4.3 YAP通过调控Arhgap28蛋白调控细胞骨架

3.4.4 YAP可以通过Arhgap28影响细胞转移和侵袭

3.5 讨论

3.6 本章小结

第四章 结论与展望

4.1全文总结

4.2后续展望

致谢

参考文献

攻读硕士学位期间取得的成果