基于“一体多用”的乌头新药用部位及制剂研究——川乌头茎叶治疗类风湿性关节炎的成药性研究

摘要

毛茛科乌头属植物乌头（Aconitum carmichaeli Debx.）是我国常用中药和四川道地药材川乌和附子的原植物。根据传统用药习惯，子根（附子）和母根（川乌）是乌头的主要收获和药用的部位，而占全植物生物量40％以上的茎叶通常都被遗弃不用。
　　本文以“一体多用”为理论基础，探寻茎叶作为川乌头新药用部位资源的可行性，首先对全植株各部位的化学成分、毒性、药效等进行系统研究，其次以治疗类风湿性关节炎为药效评价指标，以总生物碱和六种酯型生物碱为成分评价指标，对乌头新药用部位及制剂进行设计及体内外评价研究。本文的具体研究内容和结果如下：
　　1.茎叶作为新药用部位的可行性研究
　　首先研究不同发育期全植株各部位（母根、子根、须根、茎、叶）化学成分的动态差异性，综合考虑各种成分含量及产量等因素，将各部位采收期统一为6月底至7月初，此时各部位的总生物碱和双酯型生物碱含量顺序为：须根>子根>母根>叶≈茎，茎叶的总生物碱含量约为子根、须根的二分之一；TLC、HPLC、HPLC-MS研究各部位生物碱类成分差异性的结果提示各部位所含生物碱类成分的种类大体相似，均含有尼奥灵，宋果灵，六种酯型生物碱等，但含量有所差异，茎叶可能含有较多的尼奥灵，宋果灵等成分，根中酯型生物碱的含量较茎叶高。其次研究各部位的药效和毒性，各给药组均能够显著抑制冰醋酸所致小鼠扭体次数，对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀及角叉菜胶所致大鼠足肿胀均有抑制作用，表明各部位均具有良好的镇痛和抗炎作用，且茎叶与母根、子根的组间差异不明显；药材急性毒性以须根最大，子根与母根接近，茎与叶相近，明显小于根部位；根部位有明显的心脏毒性，茎叶水提液组的TD50明显大于根。综合化学成分、药效、毒性的研究结论，考虑生物产量、环境污染等因素，说明茎叶作为乌头新药用部位研究具有可行性和必要性。
　　2.茎叶总生物碱的制备及性质研究
　　在茎叶可用的基础上，以总生物碱及六种酯型生物碱含量为指标，对提取、纯化工艺进行优化，制得了总生物碱含量大于60%的有效部位，酯型生物碱以单酯型为主，有效成分苯甲酰新乌头碱含量约为32mg/g，次乌头碱约为6.19mg/g；HPLC指纹图谱表明各批次间的相似度较高，批间差异小，茎叶总碱的制备工艺稳定可行。LC-MS的研究表明茎叶总碱主要含有尼奥灵，苯甲酰新乌头原碱，次乌头碱，宋果灵，乌头碱，新乌头碱等成分。酯型生物碱在酸性条件下相对稳定，在碱性条件下易发生水解，在中性条件下水解，能“减毒存效”，故将水解条件定为 pH=7，120℃水解2h，所得水解产物中总生物碱含量大于60%，双酯型生物碱的含量极小，单酯总碱含量约为35.65mg/g。对水解前后、口服和外用茎叶总碱的LD50进行研究，总碱水解产物的安全系数较未水解的大，适合口服给药，而未水解总碱提取物外用给药，在最大给药量（1.92g/kg）时，小鼠仍未死亡，可见茎叶总碱外用的毒性明显远远低于口服，此为药效学研究奠定了基础。
　　3.茎叶总碱对大鼠佐剂性关节炎防治作用及机理研究
　　在茎叶总碱制备工艺稳定可行的基础上，在安全用量范围内，对其抗炎、镇痛、抗类风湿性关节炎的作用及机理进行研究。结果表明茎叶总碱有显著的抗炎镇痛作用，对完全弗氏佐剂所致的佐剂性关节炎具有很好的防治作用，能显著抑制大鼠足肿胀及炎细胞、纤维组织、巨噬细胞等滑膜增生性病变。口服和外用均有效，但口服组体重增长缓慢，且精神萎靡，外用组大鼠活跃，摄食积极，体重增长和正常组比较无显著性差异。口服的中毒量和有效量接近，而外用治疗窗大，说明茎叶总碱在治疗佐剂性关节炎上更适合外用给药。茎叶总碱能降低佐剂性关节炎大鼠血清中炎性介质IL-1β、TNF-α以及血清中IgG的含量，说明其可能通过抑制炎症因子以及B细胞分化、增殖等发挥其抗风湿作用。
　　4.茎叶总碱透皮贴剂的制备及体内外评价
　　在茎叶总碱外用安全有效的基础上，以经皮渗透性和黏附能力等为评价指标，筛选出总碱透皮贴剂的处方及制备工艺为：将Duro-Tak87-4098压敏胶（75.5%）和茎叶总碱提取物（20%）混匀，加入丙二醇（4.5%），真空脱气10min后静置脱气至无气泡，进行涂布，涂布厚度为0.5mm，使含药压敏胶均匀涂布在离型膜上，70℃加热20min固化，覆以背衬膜，剪切，即得。该制备工艺简单易行，可行性强。体外评价表明，制得的茎叶总碱贴剂外观美观，易于揭贴，黏附性和经皮渗透性良好，对家兔正常皮肤无刺激性，对损伤皮肤应慎用，有轻度刺激性。
　　体内评价方面，首先建立了同时测定大鼠血浆中六种酯型生物碱（BMA、BAC、BHA、MA、AC、HA）含量的HPLC-MS-MS方法，该方法专属性强，灵敏度高，精密度、回收率、稳定性均符合生物样品的分析要求。其次以口服茎叶总碱为参比，进行了大鼠贴剂透皮给药的体内药动学研究；用非隔室模型（统计距法）计算体内药动学参数。结果表明，口服给药吸收快，给药5min就可以在血浆中检测到药物，达峰浓度较高，体内滞留时间短，消除速率快，生物半衰期短；茎叶总碱透皮贴剂吸收平稳，消除时间、体内保留时间明显延长，MRT达到20h左右，能长时间维持体内有效血药浓度。经过统计分析，表明除Cmax外，透皮贴剂的六种酯型生物碱的其余各药动学参数如Tmax，AUC(0-t)，AUMC(0-t)， MRT(0-t)，t1/2z，CLz/F，Vz/F等与口服给药相比，均具有显著性差异(P<0.05)。说明茎叶总碱透皮贴剂更有利于发挥安全、有效、持久的药效作用。

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引言

选题依据

1 川乌头茎叶应用研究的立论基础——“一体多用性”

2 选择类风湿性关节炎作为切入点的依据

研究意义

1 茎叶的开发模式研究，为中药药材资源挖掘与应用提供示范

2 茎叶的应用开发研究有利于川乌头产业发展

研究思路

1茎叶作为新药用部位的可行性研究

2 茎叶总生物碱的制备及性质研究

3 茎叶总生物碱对大鼠佐剂性关节炎防治作用及机理研究

4 茎叶总生物碱部位透皮贴剂的研究

参考文献

第一部分 茎叶作为新药用部位的可行性研究

第一章 各部位化学成分研究

1 实验材料

2 各部位成分含量动态差异性（即采收期）研究

3 TLC、HPLC、LC-MS研究各部位生物碱类成分的差异性

4 小结与讨论

参考文献

第二章 各部位毒性和药效研究

1 实验材料

2 乌头各部位抗炎镇痛作用研究

3 乌头各部位毒性研究

4 小结与讨论

参考文献

第二部分 茎叶治疗类风湿性关节炎的成药性研究

第三章 茎叶总生物碱部位的制备及性质研究

1 实验材料

2 茎叶总生物碱部位的制备

3 茎叶总碱部位水解过程及水解条件研究

4 茎叶总碱部位的毒性研究

5 小结与讨论

参考文献

第四章 茎叶总碱对大鼠佐剂性关节炎防治作用及机理研究

1 实验材料

2 茎叶总碱部位的抗炎镇痛作用研究

3 茎叶总碱部位对大鼠佐剂性关节炎的防治作用研究

4 茎叶总碱治疗大鼠佐剂性关节炎的机理研究

5 小结与讨论

参考文献

第五章 茎叶总碱透皮贴剂的制备及体外评价

1 实验材料

2 制备工艺研究

3 贴剂的体外评价

4 小结与讨论

参考文献

第六章 茎叶总碱透皮贴剂的体内评价

1 实验材料

2六种酯型生物碱体内分析方法的建立

3总碱提取物口服与透皮贴剂的药动学研究

4 小结与讨论

参考文献

全文总结

1 结论

1.1阐明了茎叶作为川乌头新药用部位的可行性与必要性

1.2证明了茎叶总碱外用治疗类风湿性关节炎的安全性与有效性

1.3明确了茎叶总碱制备成透皮贴剂的科学性与可控性

2 创新点

2.1 研究思路创新

2.2 研究方法创新

3 存在的问题和展望

致谢

后置部分: 在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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