黄连解毒汤对2型糖尿病大鼠海马Alzheimer病样tau蛋白磷酸化途径的影响及机制研究

摘要

2型糖尿病（T2DM）是以胰岛素抵抗和胰岛素分泌缺陷为病理特征的常见代谢性疾病。随着糖尿病大小血管并发症的有效干预及治疗，患者的生存时间延长，大脑成为糖代谢异常作用的又一靶器官，认知损害及痴呆也成为T2DM患者新的晚期并发症。T2DM是阿尔茨海默病（AD）发病的高危风险因子，可能与其异常胰岛素水平和紊乱的葡萄糖代谢有关，如何阻断或延缓T2DM发展为AD的进程，已成为当今研究的重点和热点。本研究采用黄连解毒汤（HLJDD）为治疗药物，以链脲佐菌素（STZ）诱导T2DM大鼠模型为研究载体，通过观察大鼠学习记忆能力、脑组织形态学、PI3K-Akt/PKB信号通路以及葡萄糖代谢的变化，探讨黄连解毒汤对T2DM并发AD的治疗作用及可能机制。
　　目的：通过建立T2DM大鼠模型，经HLJDD干预治疗后，观察HLJDD对T2DM大鼠海马Alzheimer病样tau蛋白磷酸化途径的影响，并探讨其可能发生机制。
　　方法：采用“4周高糖高脂+2次STZ腹腔注射”造模法制备T2DM大鼠模型，给予HLJDD8周干预治疗后，观察大鼠一般情况（精神活动、体重、12小时进食饮水量、血糖及胰岛素水平）及HE染色脑组织病理形态学改变；Western blot观察大鼠海马总tau蛋白及tau蛋白上部分磷酸化位点（Ser199、Ser202、Thr231、Ser396）磷酸化水平，Western blot和免疫组化法检测T2DM大鼠PI3K-Akt/PKB信号通路上关键蛋白（胰岛素受体α/β、Akt、GSK-3β）的表达；在T2DM模型大鼠海马中定位注射氯化锂（LiCl）以抑制糖原合成激酶-3β（GSK-3β）活性，给予HLJDD8周干预治疗后，观察其一般情况，Western blot和免疫组化法检测LiCl大鼠海马GSK-3β，Western blot检测总tau蛋白及tau蛋白上部分磷酸化位点（Ser199、Ser202、Thr231、Ser396）磷酸化水平；Western blot和免疫组化法检测T2DM大鼠海马葡萄糖转运蛋白3（GLUT3）和tau蛋白O-GlcNAc糖基化水平。
　　结果：
　　1.HLJDD对大鼠一般情况的影响
　　①空白组大鼠精神状态良好，体重逐渐增加，进食饮水平稳；模型组大鼠表现出精神萎靡不振，倦怠少动，进食饮水量较空白组增加，小便量多，体重减轻；各给药组大鼠精神状态较模型组大鼠为好，进食饮水量略低于模型组，但均高于空白组。
　　②与空白组比较，模型组大鼠空腹胰岛素、空腹血糖、胰岛素抵抗指数以及随机血糖明显升高（P﹤0.01）。与模型组比较，各治疗组大鼠空腹胰岛素水平、空腹血糖和胰岛素抵抗指数明显降低（P﹤0.01），黄连解毒汤各剂量组之间比较无显著差异。各治疗组大鼠随机血糖与模型组相比无显著差异。
　　2.HLJDD对大鼠Morris水迷宫行为学的影响
　　①定位航行实验：模型组大鼠平均逃避潜伏期较空白组显著延长（P<0.01）；各治疗组平均逃避潜伏期较模型组明显缩短（P<0.05，P<0.01）。②空间探索实验：与空白组比较，模型组大鼠逃逸平台次数显著减少（P<0.01），有效区停留时间及有效区游泳路程均明显缩短（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，各治疗组逃逸平台次数显著增加（P<0.01），组间比较无统计学差异。除L-HLJDD组外，其他治疗组大鼠在有效区停留时间较模型组延长（P<0.05），各治疗组大鼠在有效区游泳路程，较模型组延长（P<0.05，P<0.01）。
　　3.DD对大鼠脑组织HE染色的影响
　　空白组大鼠海马区细胞带完整，锥体细胞数量多、体积大，胞膜完整，排列整齐；胞核大而圆，核膜完整，核仁明显。模型组大鼠海马区锥体细胞层数减少，排列稀疏、紊乱，细胞带不完整；神经元数量较正常对照组明显减少，可见较多呈固缩状坏死神经元；剩余神经元多见细胞肿胀，胞核染色浅，呈空泡状；细胞带附近多见胶质细胞浸润及噬神经元现象，部分细胞带附近出现大量空泡区域。经HLJDD治疗后上述病理改变明显减轻。
　　4.HLJDD对大鼠海马tau蛋白磷酸化的影响
　　Western blot检测各组大鼠海马组织中tau-5表达无显著差异；模型组大鼠海马tau蛋白在位点Ser199、Ser202、Thr231、Ser396上磷酸化的程度均明显高于空白组（P<0.05，P<0.01）；与模型组相比，M-HLJDD组的PT231外，各治疗组大鼠海马PS199、PS202、PT231、PS396蛋白表达明显下降（P<0.05，P<0.01）。
　　5.HLJDD对大鼠胰岛素信号转导通路的影响
　　①T2DM大鼠：1）各组大鼠大脑皮层IRα、IRβ蛋白表达组间比较无显著差异。2）Western blot检测各组大鼠海马组织中总Akt和总GSK-3β蛋白无显著差异；与空白组比较，模型组大鼠海马组织P-Akt和P-GSK-3β蛋白表达明显下降（P<0.01）；与模型组比较，除H-HLJDD组外，其他治疗组P-Akt和P-GSK-3β蛋白表达显著增加（P<0.05，P<0.01），组间比较无显著差异。3）免疫组化法检测各组大鼠海马CA1区总GSK-3β水平无显著差异；与空白组相比，模型组大鼠海马CA1区GSK-3β在Ser9位点上的磷酸化（P-GSK-3β）水平显著降低（P<0.01）；与模型组相比，各治疗组大鼠海马CA1区P-GSK-3β蛋白表达显著增加（P<0.01）。
　　②LiCl大鼠：1）LiCl组大鼠与T2DM组大鼠体重和12h饮食进水量变化相当，二者空腹胰岛素、空腹血糖、胰岛素抵抗指数无明显差异；与T2DM组比较，各治疗组大鼠空腹胰岛素水平、空腹血糖和胰岛素抵抗指数明显降低（P﹤0.01，P﹤0.05），黄连解毒汤各剂量组之间比较无显著差异。2）各组大鼠海马组织中总GSK-3β蛋白无显著差异；与假手术组比较，T2DM组大鼠海马P-GSK-3β蛋白表达明显降低（P<0.05）；与T2DM组比较，LiCl组大鼠海马P-GSK-3β蛋白表达明显升高（P<0.01）；而除H-HLJDD组外，各治疗组大鼠海马P-GSK-3β蛋白表达明显高于T2DM组（P<0.05）。3）Western blot检测各组大鼠海马组织中tau-5表达无显著差异；与假手术组比较，T2DM模型组大鼠海马PS199、PS202、PT231、PS396蛋白表达均明显升高（P<0.01），LiCl组大鼠海马PS199、PS202、PT231、PS396蛋白表达仍明显升高，其中PS396尤为显著（P<0.05，P<0.01）。除M-HLJDD组的PS396和H-HLJDD组的PS202外，各治疗组大鼠海马Ser199、Ser202、Thr231、Ser396蛋白表达均显著低于T2DM组（P<0.05，P<0.01）。
　　6.HLJDD对大鼠脑内葡萄糖代谢的影响的影响
　　①GLUT3：与空白组相比，模型组大鼠海马中GLUT3的含量明显减少（P<0.01）；与模型组比较，除H-HLJDD组外，HLJDD各剂量组及罗格列酮组大鼠海马中GLUT3表达显著增加（P<0.01）。
　　②tau蛋白O-GlcNAc糖基化：Western blot检测模型组大鼠海马中RL2表达较空白组明显增加（P<0.05）；与模型组比较，HLJDD各剂量组及罗格列酮组大鼠海马中RL2表达量明显增加（P<0.05）。免疫组化检测模型组大鼠海马CA1区RL2阳性蛋白表达较空白组显著下降（P<0.01）；与模型组相比，各治疗组RL2表达显著增加（P<0.01），组间比较无差异。
　　结论：
　　1.采用“4周高糖高脂+2次腹腔注射STZ”方法制备T2DM模型，造模后动物出现糖尿病典型的“三多一少”症状，在造模后8周内血糖水平保持较高水平，且死亡率较低，是一种高成模率和高稳定性的糖尿病大鼠模型制备方法。
　　2.HLJDD可有效改善T2DM大鼠学习记忆能力下降，对T2DM大鼠脑组织神经元退行性形态改变有较好的治疗作用。HLJDD对T2DM大鼠海马tau蛋白Alzheimer样过度磷酸化修饰具有较好的抑制作用。
　　3.HLJDD对T2DM大鼠脑内PI3K-Akt/PKB信号通路有较好的调控作用，但此途径不是抑制tau蛋白Alzheimer样过度磷酸化修饰的唯一方式。
　　4.HLJDD可以调节T2DM大鼠脑内葡萄糖代谢，增加其海马中GLUT3的表达，提高海马中tau蛋白O-GlcNAc糖基化修饰水平，进而负向调节tau蛋白磷酸化修饰。

目录

封面

中文摘要

英文摘要

目录

英文缩略词表

引言

1 立题依据

2 本课题工作基础和研究思路

3 技术路线图

4 实验流程图

第一部分 黄连解毒汤对T2DM大鼠认知功能及脑组织形态学的影响

序言

第一单元 T2DM大鼠模型制备

第二单元 黄连解毒汤对T2DM大鼠Morris水迷宫行为学和脑组织形态学的影响

讨论

小结

第二部分 黄连解毒汤对T2DM大鼠海马Alzheimer病样tau蛋白磷酸化水平的影响

序言

讨论

小结

第三部分 黄连解毒汤对T2DM大鼠脑内胰岛素信号转导通路的影响

序言

第一单元 黄连解毒汤对T2DM大鼠脑内PI3K-Akt/PKB信号通路的影响

第二单元 黄连解毒汤对LiCl大鼠脑内PI3K-Akt/PKB信号通路的影响

讨论

小结

第四部分 黄连解毒汤对T2DM大鼠脑内葡萄糖代谢的影响

序言

讨论

小结

结论

特色与创新

问题与展望

致谢

参考文献

文献综述一:浅议热毒与消渴呆病

文献综述二:2型糖尿病与阿尔茨海默病相关性研究进展

附录

随机数字表

附图

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

在读期间主持或参与本研究方向的科研项目

在读期间所获得的奖励

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