益气养血化瘀法调控NK细胞活性逆转大鼠肝纤维化的实验研究

摘要

目的：
　　本课题主要探讨中医药益气养血化瘀法通过调控NK细胞活性来逆转大鼠肝纤维化，为中医药益气养血化瘀法逆转大鼠肝纤维化提供科学循证依据。
　　方法：
　　第一部分：大鼠肝纤维化模型构建。除正常雄性Wistar大鼠作为空白组，余大鼠40％CCL4橄榄油混合液皮下注射（5ml/kg,2次/周，共9周），6周处死6只大鼠取肝组织动态观察肝组织HE染色、Masson染色情况，造模9周处死6只大鼠采取鼠外周血用放射免疫法检测肝纤维化指标（HA、LN），并取肝右叶组织进行肝组织HE染色、Masson染色，并用免疫组化染色S-P法、平均光密度检测肝组织α-SMA表达水平来结果确定造模成功。
　　第二部分：NK细胞与益气养血化瘀法治疗肝纤维化的相关性研究。确定大鼠肝纤维化造模成功后进行分组，第10周停止造模并分为4组：扶正化瘀胶囊治疗组、干扰素α-2b治疗组、模型对照组、空白对照组，各组均12只大鼠并编号后予以药物干预（扶正化瘀胶囊、干扰素α-2b），剩余两组大鼠予等体积生理盐水灌胃，治疗8周后停止给药禁食12小时。取股动脉血检验HA、LN；通过免疫组化的S-P法、平均光密度检测肝组织中α-SMA表达及肝组织中NK细胞数量；从鼠抗凝血中分离NK细胞，并加入CD107a及CD56的抗体，通过流式细胞仪检测CD107a/CD56阳性率；并将鼠肝星形细胞（HSC-T6）与分离的Wistar鼠NK细胞孵育并加入PI、CFSE染色剂对细胞进行标记，用荧光显微镜定性观察HSC-T6被杀伤情况及情况及流式细胞标记法检测NK细胞对HSC-T6的杀伤力。
　　结果：
　　第一部分：随着造模时间增加，大鼠逐渐精神状态及食欲稍变差，皮毛变黄，且局部皮毛有脱落；模型组大鼠肝脏边缘变钝，表面不光滑，局部稍有小结节样改变；肝脏组织病理染色可见汇管区有大量胶原纤维沉积，胶原纤维向汇管区以外延伸，部分肝脏有厚薄不等的纤维间隔形成，分割包绕肝小叶。肝纤维化指标（HA、LN）检验结果显示模型组较空白组含量增高（P＜0.05）；免疫组化S-P法、平均光密度检测α-SMA表达含量模型组较空白组明显增高（P＜0.05）。
　　第二部分：扶正化瘀胶囊组及干扰素组的大鼠精神状态、皮毛色泽较模型组大鼠有改善。肉眼观察扶正化瘀胶囊组及干扰素α-2b组大鼠肝脏外观无明显差异，局部粗糙呈颗粒状，无明显结节隆起，边缘变钝，而模型组整个肝脏呈粗大小不等结节样变化，肝脏质地较硬，部分大鼠肝脏呈黄褐色样变。肝纤维化指标结果显示扶正化瘀胶囊组、干扰素α-2b组大鼠外周血中的HA、LN含量水平相当，无明显差异，但以上两组大鼠外周血中的HA、LN均较模型组降低且具有统计学差异（P＜0.05）；通过免疫组化S-P法、平均光密度检测到扶正化瘀胶囊组及干扰素α-2b组大鼠肝组织中α-SMA含量均较模型组含量降低且有统计学意义（P＜0.05）；用同样方法测得扶正化瘀胶囊组大鼠肝组织中的NK细胞数量与其它组水平相当无明显差异。通过流式细胞仪检测外周血中NK细胞活性，结果显示与干扰素治疗组、模型对照组及正常空白组比较，扶正化瘀组的CD107a/CD56阳性率明显增高（P＜0.01），有统计学意义；也通过流式细胞标记法测得与干扰素治疗组、模型对照组及正常空白组比较，扶正化瘀胶囊组NK细胞对HSC-T6杀伤率明显增高（P＜0.01），有显著统计学差异。
　　结论：
　　第一部分：化学药物CCL4腹部皮下注射制备大鼠肝纤维化造模成功。
　　第二部分：中医的益气活血化瘀法通过调控NK细胞活性逆转大鼠肝纤维化。

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缩略词表

引言

第一部分 大鼠肝纤维化模型的建立

1实验材料

2实验方法

3实验分析

4造模结果

5结论

第二部分 NK细胞与益气养血化瘀法治疗肝纤维化的相关性

1实验材料

2实验方法

3实验分析

4结果

讨论

1中医药对肝纤维化的认识

2 NK细胞与肝纤维化的关系

3 对肝星形细胞认识

4 NK细胞杀伤毒性方法认识

5 肝纤维化动物模型的认识

结论

问题与展望

致谢

参考文献

附录

附录一 技术路线图

附录二 实验附图

综述: 肝纤维化动物模型研究进展

攻读学位期间发表学术论文及科研成果

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