清金化痰汤通过P38MAPK/NF-κB信号通路改善大鼠急性气道炎症的作用和机制

摘要

【目的】
　　观察清金化痰汤治疗急性气道炎症模型大鼠气道炎症性损伤和黏液高分泌的作用。通过观察不同时点急性气道炎症和粘液高分泌状态的变化，ELISA法检测急性气道炎症相关细胞因子及黏液分泌标志物黏蛋白的表达情况，运用免疫组化、Western blot检测急性炎症通路相关蛋白及黏蛋白的表达，分析清金化痰汤抑制急性气道炎症及黏液高分泌的可能信号机制，揭示了P38MAPK/NF-κB信号通路在调控大鼠急性气道炎症及抑制其黏液高分泌状态中的重要作用。这将进一步阐明清金化痰汤在治疗急性气道炎症性疾病中的应用价值及其作用机理,为清金化痰汤的临床应用提供实验依据，进而深入论证将“清肺化痰”法作为急性气道炎症性疾病主要治疗方法的可行性和重要性，为传统中医药走向世界奠定基础。
　　【方法】
　　1．健康雄性SD大鼠96只，随机分为6组：空白组（A组）、模型组（B组）、清金化痰汤高剂量组（C组）、清金化痰汤中剂量组（D组）、清金化痰汤低剂量组（E组）、地塞米松组（F组），每组16只。除空白组外，其余各组均用LPS气道滴入建立急性气道炎症大鼠模型，空白组则滴入等量生理盐水。
　　2．由黄芩、栀子、桔梗、麦门冬、浙贝母、橘红等十一味中药组成的清金化痰汤熬制成含生药2.98 g.ml-1的汤剂，每ml含有大鼠给药最高剂量，加水稀释2倍后为中剂量,稀释4倍后为低剂量。
　　3．造模后24h始至处死止,每日给药1次。空白组、模型组给予生理盐水灌胃0.25mL；清金化痰高、中、低剂量组分别给予清金化痰汤剂灌胃，按大鼠用药量与人的倍数换算为等效剂量，即中剂量，250g大鼠相当于人用药量6倍（高剂量为7.44 g.kg-1，中剂量为3.72 g.kg-1，低剂量为1.86 g.kg-1），每只大鼠每次灌服2.5ml；地塞米松组按照0.001 g.kg-1的剂量腹腔注射地塞米松磷酸钠注射液。
　　4．观察各组大鼠BALF中白细胞及细胞分类计数；光镜下观察气管和肺组织病理学改变；用ELISA法检测BALF中细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α以及黏蛋白MUC5AC的表达；以确定急性气道炎症及黏液高分泌状态。
　　5．用免疫组织化学方法检测肺组织中粘蛋白MUC5AC、P38MAPK蛋白表达情况；以Western blot法测定肺组织中P38MAPK，IκBα，NF-κBP65的蛋白表达水平。
　　6．统计方法
　　采用SPSS17.0统计软件，计量资料采用均数±标准差（x±S）进行统计描述，组间差异比较采用one-way ANOVA方差分析；单因素相关性应用Pearson相关分析，以P<0.05或P<0.01被认为差异有统计学意义。
　　【结果】
　　1.一般情况观察：与空白组比较，各组大鼠在造模后出现活动减少，反应迟钝，双目无神，进水、进食减少，毛发色泽黯淡，口角、鼻孔可见分泌物流出，可闻及咳嗽及痰鸣音；与模型组比较，各治疗组在给药后上述症状、体征得到改善，其中以第7d清金化痰汤高剂量组最为明显，其次为清金化痰汤中剂量组和地塞米松组。
　　2. BALF中白细胞总数和细胞分类：模型组BALF中白细胞总数与同时相空白组比较均有显著升高；清金化痰汤高、中、低剂量组和地塞米松组与同时相模型组比较,白细胞总数均有明显降低(P<0.05或P<0.01)，其中清金化痰汤高剂量组第7d白细胞总数基本接近空白组；细胞分类显示,模型组的中性粒细胞和淋巴细胞与同时相空白组比较均有明显增加，清金化痰汤高、中、低组与同时相模型组相比，中性粒细胞和淋巴细胞均有降低（以高剂量组第7d降低明显），巨噬细胞升高，其余各时相大、中剂量组均无明显差异。说明清金化痰汤和地塞米松能抑制气道急性炎症时白细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的增多。
　　3.气管和肺组织病理改变：空白组大鼠支气管黏膜上假复层纤毛柱状上皮排列整齐，肺泡结构清晰完整，肺间隔未见增厚，肺泡腔未见炎性细胞浸润，肺间质无水肿。模型组可见气管管壁、肺血管及部分肺泡腔内有炎性细胞浸润（以中性粒细胞、淋巴细胞为主）和大量红细胞渗出，气管腔内可见上皮细胞脱落，肺泡间隔明显增厚，肺间质充血、水肿。给予清金化痰汤后炎症程度减轻，其中以第7d高剂量组最为明显。经炎症分级统计，LPS诱导急性气道炎症大鼠各组与同时相空白组相比较，支气管及肺组织炎症积分均明显升高；与同时相模型组比较，清金化痰汤高、中、低剂量组和地塞米松组病理学炎症积分均明显降低，而以清金化痰汤高剂量组第7d降低尤为明显。说明清金化痰汤和地塞米松均能明显降低支气管及肺组织炎症积分，使上皮损害减轻,炎性细胞浸润减少。
　　4. ELISA检测相关细胞因子及黏蛋白MUC5AC：与同时相空白组相比，模型组BALF中IL-1β，IL-8，TNF-α，MUC5AC均有显著升高(P<0.05或P<0.01)；与同时相模型组相比，清金化痰汤高，中，低剂量组（除低剂量第4d天外）和地塞米松组BALF中IL-1β，IL-8， TNF-α，MUC5AC均显著降低，以高剂量组第7d降低明显，P<0.05或P<0.01。
　　5. SP法检测MUC5AC、P38MAPK蛋白的表达：与同时相空白组相比，模型组肺组织中MUC5AC、P38MAPK的表达均有显著升高(P<0.05或P<0.01)；与同时相模型组相比，清金化痰汤高，中，低剂量组（除低剂量第4d天外）和地塞米松组肺组织中MUC5AC、P38MAPK的表达均显著降低，以高剂量组第7d降低明显，P<0.05或P<0.01。
　　6. Western blot测定肺组织P38MAPK、IκBα、NF-κBP65的表达情况：与同时相空白组相比，模型组中P38MAPK，NF-κBP65蛋白的表达均显著升高，而IκBα的表达明显降低(P<0.05或P<0.01），与同时相模型组相比，清金化痰汤高、中、低剂量及地塞米松组，大鼠肺组织P38MAPK，NF-κBP65表达均显著降低，而IκBα的表达明显升高（P<0.05或P<0.01）。
　　7.相关性分析结果显示实验第7d，肺组织P38MAPK蛋白表达量与BALF中白细胞总数、TNF-α、肺组织中MUC5AC、NF-κBP65比较呈明显正相关。
　　【结论】
　　1.本研究证实LPS诱导的急性气道炎症大鼠模型BALF中炎性细胞、细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α，黏蛋白MUC5AC表达明显增多，支气管及肺组织炎症积分均明显升高，说明成功建立急性气道炎症模型大鼠。
　　2.实验发现给予清金化痰汤治疗后BALF中炎性细胞、细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α，支气管及肺组织炎症积分均较模型组有明显的减少，有显著差异；Western blot检测肺组织P38MAPK、IκBα、NF-κBP65的表达量，其中P38MAPK、NF-κBP65表达较模型组有明显减少，而IκBα蛋白的含量明显增加，有显著性差异。实验第7d肺组织中P38MAPK与BALF中白细胞总数、TNF-α、肺组织中NF-κBP65之间呈正相关，由此表明清金化痰汤主要是通过调控细胞因子TNF-α介导的P38MAPK/ NF-κB信号通路，下调P38MAPK、NF-κB信号蛋白，抑制IκBα的降解，从而抑制气道炎性细胞分泌和细胞因子的释放，改善气道炎症性损伤。
　　3.实验发现给予清金化痰汤治疗后BALF中黏蛋白MUC5AC较模型组含量明显减少，有显著差异；SP法检测肺组织中MUC5AC、P38MAPK阳性表达较模型组明显减少，有显著差异；而Western blot检测肺组织P38MAPK、IκBα、NF-κBP65的表达量，其中P38MAPK、NF-κBP65表达较模型组有明显减少，而IκBα蛋白的含量明显增加，有显著性差异。实验第7d肺组织中P38MAPK与肺组织中MUC5AC之间呈正相关，由此证明清金化痰汤能够抑制气道黏液高分泌主要是通过调控P38MAPK/NF-κB信号通路，下调P38MAPK、NF-κB，从而减少黏蛋白MUC5AC的表达，以改善气道黏液高分泌状态。
　　4.实验发现清金化痰汤通过调控细胞因子介导的P38MAPK/NF-κB信号通路，抑制炎症信号通路活性，进而减少气道炎症反应，发挥抗黏液高分泌，产生对气道的保护作用，且具有量效依赖性。
　　5.从以上结果可以推测清金化痰汤改善大鼠急性气道炎症的调控机制是：清金化痰汤→激活P38MAPK信号传导通路→下调P38MAPK→抑制IκBα蛋白的降解→下调NF-κBP65→抑制炎性细胞、IL-1β、IL-8、TNF-α、MUC5AC的表达→生物学效应→抑制急性气道炎症反应及黏液高分泌状态。

目录

缩略词表

引言

第一部分 材料与方法

1. 实验动物

2. 实验药物

3. 主要试剂、仪器及溶液配制

4. 实验动物分组

5. 急性气道炎症模型的建立

6. 药物制备

7. 给药方法

8. 标本采集与处理

9. 一般情况观察方法

10. BALF白细胞计数与分类

11. 病理学检测

12. ELISA法

13. 免疫组化S-P法

14. Western blot

15. 统计方法

16．技术路线

第二部分 结 果

1. 一般情况观察

2. 清金化痰汤对 BALF 中白细胞总数和细胞分类的影响

3. 清金化痰汤对急性气道炎症大鼠气管和肺组织病理改变的影响

4. 清金化痰汤对 BALF 中相关细胞因子水平的影响

5. 清金化痰汤对 BALF 中黏蛋白 MUC5AC 水平的影响

6. S-P法检测清金化痰汤对肺组织中P38MAPK、MUC5AC的影响

7. Western Blot 检测清金化痰汤对肺组织P38MAPK、IκBα、P65的影响

8. 相关性分析

第三部分 讨论

1. 中医对急性气道炎症性疾病的认识

2. 现代医学对急性气道炎症性疾病的认识

3. 气道炎症与黏液分泌

4. 气道炎症与信号通路

5. 急性气道炎症模型的建立

6. 清金化痰汤治疗后能明显抑制急性气道炎症反应

7. 清金化痰汤下调肺组织 P38MAPK/NF-κB 信号通路，以抑制气道炎症反应

8. 清金化痰汤下调肺组织P38MAPK/NF-κB信号通路，以抑制气道黏液高分泌

第四部分 结 论

不足和展望：

参考文献

附录文献综述:气道炎症性疾病发病机制的研究概况

在读期间公开发表的学术论文、专著及科研成果

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