线粒体苯二氮卓类受体在低氧训练防治心室颤动中的作用

摘要

背景：心室颤动是心室肌的快速无效收缩或彻底的不协调的颤动。心室颤动发生时，心室不能产生任何有效收缩力量，外周动脉血压迅速降至最低水平。心室颤动是导致心源性猝死最主要的心律失常，约95％的猝死归因于心室颤动。我国目前心脏猝死发生总数约54万/年，美国每年大约近60万人死于心脏猝死。心室颤动被公认为世界上最凶险的一种疾病，严重地威胁着人类的生命和健康。然而，目前除了埋藏式心脏可自动转复除颤器以外，心室颤动尚缺乏有效的预防和治疗手段。
　　 流行病学调查已经显示，高原居住的人群或者经常到高原旅行的人群，其心律失常的发生率较平原居住的人群显著降低。动物实验研究也明确显示，慢性或间断性低氧处理可以对抗心肌缺血再灌注损伤以及包括心室颤动在内的多种心律失常的发生。以上研究均提示我们，低氧训练可以阻止心室颤动的发生，但是其具体机制目前仍是众说纷纭、莫衷一是。
　　 心脏是一个高度依赖于能量的器官，心肌细胞中含量最丰富的细胞器是线粒体。线粒体是细胞内能量的加工场，线粒体功能的紊乱被认为与包括心律失常在内的多种心脏疾病密切相关。线粒体苯二氮卓类受体.mBzR)是一种广泛表达的、位于线粒体内外膜交界处的应激蛋白。在各种急性应激条件下，大脑、肾脏和心脏中的mBzR水平都显著增加。目前认为，细胞抵抗应激损伤的能力与mBzR的表达水平密切相关。心律失常也是一种应激事件，有研究已经证实，抑制mBzR可以抑制再灌注性心室颤动的发生。最近，我们的研究发现，mBzR活性爆发式的升高是发生缺血性心室颤动根本，激动或者抑制该受体可以导致心室颤动发生的“全”或“无”现象。
　　 低氧训练可以抑制心室颤动的发生，但是其具体机制如何？mBzR是否在低氧训练防治心室颤动中发挥重要作用？如果mBzR发挥着重要的作用，那么其发挥作用的具体机制又是什么？这些科学问题亟待探索。
　　 目的：研究mBzR在低氧训练防治心窒颤动中的作用，探讨低氧训练防治心窒颤动的分子机制。
　　 方法建立Langendorff灌流的离体大鼠心室颤动模型，比较对照组和低氧训练组心室颤动的发生率。在此基础之上，运用mBzR激动剂和抑制剂分别干预未经低氧训练和经历低氧训练的大鼠，观察各组心室颤动的发生率，以期初步确定低氧训练可以防治心室颤动的发生，且该效应可能与抑制mBzR相关。提取以上各组的心肌组织的线粒体，运用放射性同位素法检测mBzR活性的变化，确定低氧训练防治心室颤动的发生是否与改变mBzR活性相关。急性分离大鼠心室肌细胞，在心室肌细胞上模拟上述各组处理，运用TILLvisION钙成像系统分析心室肌细胞胞浆静息钙水平的变化，运用激光共聚焦显微镜分析心室肌细胞钙动力学的变化，并运用实时定量荧光PCR技术检测mBzR和相关钙调蛋白的mRNA水平变化，从而部分明确低氧训练通过抑制mBzR活性来防治心室颤动的机制。
　　 结果:低氧训练组心室颤动的发生率为16.7％(2/12)，而对照组为80.(24/30)，具有显著统计学差异(p<0.01)：经mBzR的激动剂FGIN-1-27处理后，上述心室颤动发生率并无明显变化，低氧训练组为16.7.(2/12)，对照组为90.(9/10)；经mBZR的抑制剂4’-Cl-DZP处理后，两组低氧训练组发生率均为0％。放射性同位素检测发现，心室颤动发生时mBzR活性显著增加，而低氧训练组心脏缺血后该受体活性无明显变化。运用实时定量荧光PCR检测mBzR的关键亚基IBP的mRNA的表达发现，缺血并不改变对照组大鼠心肌IBP的mRNA表达。但是，低氧训练组大鼠心肌在平衡无缺血时IBP的表达已经上调。TILLvisION钙成像系统检测发现，缺血时对照组心肌细胞[Ca2+]i进行性上升，但是在低氧训练组大鼠心肌细胞内并未观察到有明显的钙超载。mBzR的激动剂FGIN-1-27并不能破坏低氧训练组大鼠心肌细胞内钙稳态，该受体的抑制剂4’-Cl-DZP可以减轻对照组大鼠心肌细胞钙超载。激光共聚焦显微镜检测发现，低氧训练可以维持心肌缺血时的钙动力学稳态。实时定量荧光PCR检测钙调蛋白的mRNA水平发现，低氧训练组大鼠心肌SERC.2A和RyR的mRNA水平高于对照组，缺血使对照组大鼠心脏SERC.2A和RyR的mRNA的表达上调，而在低氧训练组两者趋于稳定。此外，激动或抑制mBzR活性并不改变两组大鼠CASQ的mRNA的表达，但在平衡和缺血阶段，低氧训练却可以上调和稳定它的表达。
　　 结论:低氧训练可以降低缺血时mBzR的活性，稳定钙调蛋白的表达，抑制细胞内钙超载，防治心室颤动的发生。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

第1章 前言

1.1 低氧训练的心脏保护作用

1.2 心室颤动及其机制

1.3 线粒体与心律失常的关系

1.4 低氧训练是通过抑制mBzR受体防治心室颤动的吗?

第2章 材料与方法

2.1 对象

2.2 材料

2.2.1 主要试剂

2.2.2 主要试剂盒

2.2.3 主要仪器

2.2.4 主要溶液配方

2.2.5 引物序列

2.3 方法

2.3.1 低氧训练

2.3.2 实验分组

2.3.3 心室颤动的诱发

2.3.4 mBzR活性测定

2.3.5 IBP的mRNA表达定量

2.3.6 细胞内游离钙浓度和钙动力学变化的检测

2.3.7 钙处理蛋白mRNA水平的定量

2.3.9 统计学分析

第3章 结果

3.1 低氧训练通过抑制mBzR发挥抗心律失常效应

3.2 心肌组织mBzR活性和IBP的mRNA变化检测

3.3 低氧通过稳定mBzR活性维持细胞内钙稳定

3.4 低氧训练通过抑制mBzR活性稳定钙处理蛋白

第4章 讨论

第5章 结论与展望

5.1 结论

5.2 进一步的工作

参考文献

致谢

附录A综述:线粒体与快速性心律失常的关系

附录B个人简历、在读期间发表的学术论文与研究成果