SmDXS2基因遗传转化丹参毛状根对其丹参酮含量的影响

摘要

丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)作为一种传统中药主要应用于临床对心血管系统疾病的治疗。丹参酮作为其主要有效成分之一具有消炎、抑菌、抗氧化及抗癌等多种生物活性。然而由于丹参野生资源日益减少,栽培丹参生长周期较长,品质严重退化,药用活性成分含量低远不能满足市场要求等问题,使得如何使丹参这一原料药材的供应在数量和质量上能更好地满足临床应用的需求成了一个研究热点。
　　 本课题采用基因工程手段,从分子水平上对丹参酮生物合成途径进行改造,首次将关键酶基因SmDXS2遗传转化丹参,利用构建1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸(DXP)途径中第一个关键酶-1-脱氧-D-木酮糖合成酶(1-deoxy-D-xylulose5-phosphate synthase,DXS)基因的一个成员SmDXS2的过量表达载体(pCAMBIA1304++SmDXS2)以及抑制表达载体(pCAMBIA1304++Anti-SmDXS2),通过农杆菌C58C1介导遗传转化丹参,将SmDXS2和Anti-SmDXS2基因转入丹参,并获得转基因毛状根。进而分析SmDXS2在阳性转基因毛状根株系中的表达变化情况,同时测定阳性转基因毛状根株系的丹参酮含量,从而研究关键酶基因SmDXS2在丹参酮合成代谢通路中所发挥的作用。所取得的结果如下:
　　 1.载体构建和工程菌制备:在本实验室前期工作基础之上,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304++SmDXS2和pCAMBIA1304++Anti-SmDXS2。用冻融法将两个表达载体质粒分别导入农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)C58C1中,PCR检测结果说明成功获得了用于遗传转化的C58C1工程菌；
　　 2.丹参遗传转化:用农杆菌介导法转化丹参叶片,结果分别获得SmDXS2阳性毛状根克隆46个和Anti-SmDXS2阳性克隆34个；
　　 3.基因整合:PCR检测中,分别在植物表达载体上组成型启动子CaMV35S的内部及插入基因的内部设计上游及下游特异性引物进行DNA的PCR扩增,结果证实获得18个SmDXS2阳性克隆,阳性率为39.1％,14个Anti-SmDXS2阳性克隆,阳性率为41.2％；
　　 4.转录水平表达:半定量RT-PCR结果显示,SmDXS2在不同克隆中的表达水平不同,且SmDXS2阳性克隆的表达量明显高于Anti-SmDXS2阳性克隆；
　　 5.丹参酮含量:利用HPLC测定丹参转基因毛状根中丹参酮含量,结果表明,过量表达SmDXS2的克隆中丹参酮含量显著高于对照组,其中最显著的克隆丹参酮含量是对照组(0.58mg／g DW)的4.51倍,而抑制表达的克隆中丹参酮含量低于对照组。
　　 本研究通过过量表达关键酶基因SmDXS2,成功获得了丹参酮含量显著提高的丹参转基因毛状根,打破丹参酮生物合成途径的瓶颈效应,获得高产丹参酮的丹参毛状根,为商业化生产丹参酮提供新型优质药源。

目录

文摘

英文文摘

答辩委员会审查意见

缩写词表

第一章 文献综述

1.1 丹参概述

1.2 丹参的脂溶性成分丹参酮的作用

1.3 丹参人工培养及次生代谢研究

1.3.1 植物次生代谢产物及其主要功能

1.3.2 毛状根培养技术

1.3.3 诱导子处理对丹参毛状根产生次丹参酮的影响

1.3.4 转基因方法提高植物次生代谢产物

1.4 丹参酮生物合成途径及其相关酶的调控研究

1.4.1 甲羟戊酸(MVA)途径

1.4.2 1-脱氧-D-木酮糖-5磷酸(DXP)途径

1.4.3 丹参酮生物合成途径及其相关酶的研究现状

1.5 本实验研究的目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验材料

2.1.1 植物材料

2.1.2 载体及菌种

2.1.3 实验常用试剂配方

2.2 实验方法

2.2.1 植物表达载体pCAMBIA1304++SmDXS2的构建

2.2.2 植物表达载体pCAMBIA1304++anti-SmDXS2的构建

2.2.3 植物表达载体转化发根农杆菌C58C1

2.2.4 C58C1介导SmDXS2、anti-SmDX2遗传转化丹参获得毛状根

2.2.5 转基因丹参毛状根的PCR检测

2.2.6 转基因丹参毛状根的RT-PCR检测

2.2.7 利用HPLC测定转基冈丹参毛状根中丹参酮含量

2.2.8 利用HPLC测定转基因丹参毛状根中酚酸类含量

第三章 结果与讨论

3.1 植物表达载体pCAMBIA1304++SmDXS2的构建

3.1.1 BglⅡ不完全酶切最佳时间的探索

3.1.2 pCAMBIA1304++SmDXS2载体构建的分子检测

3.1.3 pCAMBIA1304++SmDXS2 in C58C1分子检测

3.2 植物表达载体pCAMBIA1304++Sm anti-DXS2的构建

3.3 丹参遗传转化

3.4 转基冈毛状根的PCR检测

3.5 转基因毛状根的RT-PCR分析

3.6 HPLC测定转基因丹参毛状根中丹参酮含量

3.6.1 高效液相色谱(HPLC)方法的建立

3.6.2 过量表达SmDXS2丹参毛状根中丹参酮含量测定

3.6.3 抑制表达SmDXS2丹参毛状根中丹参酮含量测定

3.7 HPLC测定转基因丹参毛状根中酚酸类含量

3.7.1 高效液相色谱(HPLC)方法的建立

3.7.2 过量表达SmDXS2丹参毛状根中酚酸类含量测定

3.7.3 抑制表达SmDXS2丹参毛状根中丹参酮含量测定

3.8 讨论

第四章 总结与展望

4.1 研究结论

4.2 展望

4.2.1 SmDXS1的过量和抑制表达遗传转化丹参

4.2.2 SmDXS2和SmGGPPS共转化遗传转化丹参

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文及专利