日本血吸虫体被蛋白SjTSP1LHD重组蛋白和SjGCP核酸疫苗免疫保护效果初评估

摘要

血吸虫病(Schistosomisis)是由血吸虫感染引起的一种危害严重、分布广泛的人兽共患寄生虫病。目前，对血吸虫病的治疗是以吡喹酮化疗为主，但是依靠单纯的化疗只可能降低血吸虫患病的几率，而不能防止人畜的再感染，也不能阻断血吸虫病的传播。且长期使用化学药物，耐药性的风险也逐步加大。由于血吸虫感染宿主后不能产生足够的免疫保护力，因此，发展血吸虫疫苗被认为是防治血吸虫感染的有效方法。本研究选取了日本血吸虫的两个体被蛋白基因SjTSP1LHD和SjGCP分别将其克隆至原核和真核表达载体中，制成蛋白疫苗和核酸疫苗，进行动物保护实验，分别评估两种疫苗的免疫保护效果，并初步探讨它们的免疫保护机制，为筛选疫苗候选分子奠定基础。
　　 ⑴日本血吸虫SjTSP1LHD基因克隆、表达及免疫效果的初步评估。本研究首先通过生物信息学分析，确定表达四跨膜蛋白SiTSP1大亲水区基因编码序列，以日本血吸虫42d成虫cDNA为模板PCR扩增该序列，并构建了重组表达质粒SjTSP1LHD-pET-32a(+)，经IPTG诱导以包涵体形式表达，以日本血吸虫α-tublin为内参，RT-PCR分析表明其在血吸虫各个时期虫体中都有转录，western-blot检测出该重组蛋白的免疫原性良好，免疫组化实验，表明该蛋白主要分布在虫体体被表膜，将重组蛋白免疫BALB/c小鼠，攻击感染血吸虫尾蚴，42d剖杀小鼠冲虫，得到22.45％减虫率和35.72％的肝脏减卵率，与对照组相比差异显著，具有一定的免疫保护效果。ELISA检测免疫小鼠血清中特异性IgG及其亚型IgG1、IgG2a，结果表明三次免疫后，抗体水平逐渐升高，且IgG2a/IgG1比值逐渐降低，免疫组细胞因子IL-4、IFN-γ水平显著升高，表明该重组蛋白诱导了Th1/Th2混合型免疫反应，并以Th2型免疫反应占主导地位。
　　 ⑵日本血吸虫抱雌沟蛋白(SjGCP)核酸疫苗的研究。将编码日本血吸虫大陆株抱雌沟蛋白基因完整ORF片段克隆到真核表达载体pVAX1中，构建重组表达质粒pVAX1/SjGCP，三次肌肉注射BALB/c小鼠后，攻击感染血吸虫尾蚴，42d剖杀小鼠冲虫，计算减虫率及肝脏、粪便减卵率，评估其免疫保护效果。用流式细胞术(FCM)检测三次免疫后小鼠淋巴细胞亚群CD4+、CD8+占总淋巴细胞的百分比及细胞因子IL-4、IFN-γ表达水平，探讨pVAX1/SjGCP核酸疫苗的免疫机制。小鼠经重组真核质粒免疫后诱导了37.93％的减虫率，及44.06％、65.46％的肝脏减卵率和粪便减卵率，与pVAX1组相比差异显著。流式细胞术检测表明重组质粒免疫组淋巴细胞亚群CD4+、CD8+百分比增加，细胞因子IFN-γ及特异性IgG水平提高，与pVAX1组比较差异显著。在抗日本血吸虫保护性免疫中，抱雌沟蛋白基因DNA疫苗能够诱导小鼠细胞免疫和体液免疫应答，产生Th1/Th2型混合的免疫反应，且以Th1型免疫反应占优势地位，具有一定的抗血吸虫感染的免疫保护效果。