非病毒载体介导的热诱导基因治疗

摘要

基因治疗(Gene therapy)是将外源性遗传物质输送到靶细胞,以改善由于基因缺陷和变异引起的疾病,达到治疗目的.基因治疗中的关键问题主要是基因的输送和基因进入细胞后的表达调控.目前,在基因输送方面,主要分为病毒载体和非病毒载体两大类.在调控基因的表达上,大多在基因的转录水平上进行调控,利用一些受物理或化学因素诱导的启动子元件构建出受这些理化因素诱导的真核表达载体,从而实现对基因表达的调控.对于热诱导的基因表达,我们主要研究了加热诱导后,基因表达随时间变化的过程,在细胞实验中,基因表达在热诱导后8小时内达到最大值,基因诱导倍数在100倍以上,之后三天内便可以降至较低的水平.体内实验也与此相似,在加热后的24小时内,基因表达达到最大值,之后三天内降至背景表达的水平.我们还比较了39oC和41oC加热条件下,在体基因表达的情况.更为重要的是,在体内实验中,我们尝试了在第一次诱导基因表达后,再次诱导基因表达.结果显示热诱导的基因在第一次被诱导表达后,可以再次被诱导表达,从而在时间上实现了对基因表达的调控.另外,我们自行搭建了一套聚焦超声加热系统用于在体的基因诱导.超声加热的优点就在于它可以三维聚焦于肌体的局部,减少对其它正常组织的损伤.在实验中,外源基因只在超声聚焦的部位表达,从在空间上实现了对基因表达的控制.

目录

摘要

第一章 非病毒基因治疗可控研究概述

一、基因治疗概述

1. 基因治疗的概念

2. 基因治疗的途径

3. 基因治疗中的几个关键问题

二、非病毒载体介导的基因治疗

1. 基因治疗的基因导入系统

2. 非病毒载体的特点

3. 基因输送的靶向性

三、可控基因治疗的研究

1. 可控基因治疗实现的原理

2. 几种应用于基因治疗的诱导型启动子

四、本课题的内容

第二章 实验仪器 材料

一、实验材料

二、实验仪器

第三章 实验方法

一、质粒的构建

1. 质粒酶切

2. 凝胶中回收DNA片断

3. DNA片断连接

4. 重组质粒酶切鉴定

5. 重组质粒大规模制备

二、细胞培养

三、细胞基因转染

四、体内基因转染

五、细胞和体内热诱导基因表达

六、诱导后基因表达的测定

1. Luciferase活性测定

2. 比色法（Bradford法）测定细胞总蛋白质浓度

七、肌肉损伤检测

八、小鼠加热红外图像

第四章 实验结果

一、重组质粒构建

二、热诱导基因治疗的细胞实验

1. 比色法测定蛋白浓度标准曲线

2. 热诱导基因表达的时间曲线

3.热诱导基因重复表达的细胞实验（on-off-on）

4. 不同时间点诱导基因表达的细胞实验

5. 热诱导作为基因表达的"开关"

三、热诱导基因治疗的在体实验

1. 加热温度对基因诱导表达的影响

2. 体内热诱导基因表达时间曲线

3. 不同时间点在体热诱导基因表达（on-on）

4. 体内热诱导基因重复表达（on-off-on）

四、加热小鼠的体表温度分布

1. 加热后立即拍摄

2. 加热后散热

五、热对肌肉的损伤情况

1. 加热后立即的肌肉损伤情况（39oC 、41oC）

2. 加热后一天的肌肉损伤情况

3. 加热后三天肌肉损伤

第五章 讨论

一、表达质粒的差异

二、加热温度

三、加热系统

四、热诱导作为基因开关

五、展望

致 谢

参考文献

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