假单胞菌株M18藤黄绿菌素的生物合成基因簇、调控基因pltZ及其ABC转运基因簇的鉴定与功能研究

摘要

假单胞菌株(Pseudomonassp.)M18产生藤黄绿菌素(Pyoluteorin，Plt)与吩嗪-1-羧酸(Phenazine-1-carboxylicacid，PCA)两种不同类型的抗生素，能抑制多种植物病原菌，是一株重要的生物防治菌株。本研究克隆、测序并鉴定了M18藤黄绿菌素生物合成基因簇及其下游序列共32.8kb的基因组区域，序列分析发现该区域共包含20个开放阅读框(ORF)，plt基因簇由位于其中22-kb基因组区域的10个ORF组成：操纵子pltLABCDEFG、转录调控基因pltR、部分pltM基因，M18plt基因簇的基因组成、分布、大小与荧光假单胞菌Pf-5的基本相似。在plt基因簇下游8-kb基因组区域，首次发现并鉴定了一个新的藤黄绿菌素生物合成负调控基因pltZ和一个新的涉及藤黄绿菌素免疫、促进藤黄绿菌素合成与分泌的ABC(ATP-bindingcassette)转运基因簇pltHIJKNO，并预测提出了一个可能的藤黄绿菌素转运机制模型。在pltZ和pltHIJKNO功能鉴定的基础上，本课题还研究证实：pltZ转录阻抑ABC转运系统PltHIJKNO的表达，藤黄绿菌素能同时诱导自身生物合成基因和ABC转运系统PltHIJKNO的表达。研究藤黄绿菌素生物合成的分子调控、转运分泌及自身免疫机制，对于通过基因工程提高抗生素产量及其生物防治能力、实现抗生素生产工业化具有十分重要的意义。 pltZ编编码蛋白质序列与其它TetR家族细菌调控蛋白具有广泛的同源性，PltZ蛋白的第19～65个氨基酸残基间存在一个TetR家族调控蛋白的特征序列模体，其中第23～59个氨基酸残基编码一个HTH(helix-turn-helix)DNA结合结构域。pltZ基因的突变引起藤黄绿菌素合成量比野生型提高4.4倍，而对吩嗪-1-羧酸的合成没有影响。pltZ对藤黄绿菌素生物合成的负调控作用通过pltZ的过表达实验与pltA'-'lacZ翻译融合分析得到进一步证实。 藤黄绿菌素ABC转运基因簇位于pltZ下游7.5kb基因组区域内，由pltH、I、J、K、N、O六个基因组成，作为一个单独的转录子，在pltZ相反方向转录，生物信息学分析预测显示：这六个基因依次分别编码一个膜融合蛋白PltH、一个Ⅱ型ATP结合蛋白PltI、两个内膜整合通透酶蛋白PltJ与PltK、一个外膜通道蛋白PltN及一个跨膜蛋白PltO，共同组成一个完整的ABC转运系统。Plt的生物合成需要该ABC转运系统的表达，pltH或pltI的突变菌株均未合成可探测水平的Plt，ABC转运系统的过表达显著提高M18菌株合成Plt的能力。在大肠杆菌DH5α菌株中异源表达ABC转运基因簇不同基因或区域，测定该菌株对Plt的敏感性(最小抑制浓度)；在含有15μgmL-1和12.5μgmL-1Plt的LB培养基中，分别测定携带完整ABC转运系统表达质粒pZX141的E.coliDH5α与空质粒(pME6032)对照菌株的生长动力学；两实验结果表明：完整的ABC转运系统负责对Plt的免疫或抗性。ABC转运系统对Plt生物合成的促进功能及其Plt抗性机制均可能由该ABC转运系统分泌与外排Plt的功能所介导，就此提出了一个可能的Plt转运机制模型。 在野生型M18菌株和pltZ突变菌株M18Z中，ABC转运基因pltH'-‘lacZ翻译、转录融合表达的结果表明：pltZ转录阻抑PltABC转运系统的表达。pltZ有可能通过阻抑PltABC转运系统的表达，间接地负调控Plt的生物合成。 在添加或不添加外源Plt(终浓度10μgmL-1)的KMB培养基中，分别在野生型M18菌株和Plt-突变菌株M18T中进行pltA'-‘lacZ翻译融合与pltH'-‘lacZ翻译、转录融合表达，结果表明：Plt对自身生物合成基因簇及其ABC转运系统的表达在转录水平上具有显著的诱导作用。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：上海交通大学学位论文答辩决议书

上海交通大学学位论文原创性声明及上海交通大学学位论文版权使用授权书

第一章 绪论

第二章 假单胞菌株M18藤黄绿菌素生物合成基因簇及其下游10kb基因组序列的克隆、测序及初步鉴定

第三章 假单胞菌株M18藤黄绿菌素生物合成的负调控基因pltZ的鉴定及其功能研究

第四章 假单胞菌株M18藤黄绿菌素ABC转运基因簇的鉴定及功能研究

4.1引言

4.2材料与方法

4.3结果

4.4讨论

第五章 pltZ基因转录阻抑藤黄绿菌素ABC转运系统的表达

第六章 藤黄绿菌素诱导自身生物合成基因及其ABC转运系统的表达

第七章 总结

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表论文情况