NUP98-IQCG的克隆及功能研究

摘要

恶性肿瘤尤其是白血病中常伴随有非随机性遗传学异常，如易位，缺失，倒位和扩增等。近三十多年来，对肿瘤细胞伴随的特异染色体异常的研究使我们认识了大量在疾病恶性转化中起重要作用的原癌基因。功能研究显示这些异常能干扰细胞增殖、分化和成熟的正常调控途径，从而在人类肿瘤的发病机制中起重要作用。因此，分离特异染色体异常所累及的基因，阐明其致病的分子机制及与临床的关系，不仅成为肿瘤分子病理学中最引人注目的研究方向之一，而且为白血病和实体瘤的诊断、分型及预后判断提供了重要依据。 本实验室曾在8000余例标本分析的基础上，在国际上发现了三种NUP98相关的染色体易位：急性髓细胞性白血病t(7；11)(p15；p15.5)，t(11；12)(p15.5；q13)和t(1；11)(q23；p15.5)，分别产生NUP98-HOXA9、NUP98-HOXC11、NUP98-PMX1融合基因。最近又与苏州大学附属第一医院、江苏省血液研究所合作，在一例伴t(3；11)(q29q13；p15)易位的急性T/髓细胞性白血病患者中克隆了NUP98-IQCG融合基因。进而对所形成的融合蛋白的致白血病机制进行了初步的研究。 第一部分，先是克隆了此例患者染色体易位中所形成的融合基因。根据患者异常核型的提示做FISH，证实11号染色体上受累基因是NUP98基因。随后通过3’cDNA末端快速扩增技术(RapidAmplificationofcDNAEnds，RACE)识别了位于3q29的NUP98新的伙伴基因IQCG(IQmotifcontainingG)。分子生物学分析显示NUP98基因的13号外显子与IQCG基因的10号外显子相融合，发现同时还存在另一种变异性转录本(NUP98-IQCG-v)，在NUP98基因的13号外显子与IQCG基因的10号外显子之间插入了72bp的一段序列，这2种融合基因转录本都保留了完整的阅读框架。应用QRT-PCR方法，分析了IQCG在人类各个组织中的表达，以睾丸和胃组织中的表达最高，心脏和骨髓中的表达最低。IQCG蛋白序列同源性分析显示，在7个物种(人，黑猩猩，猴子，大鼠，小鼠，鸡和苍蝇)中存在IQCG同源性序列，提示它们在进化中有共同的祖先。人、猴子和鼠的IQCG蛋白中都有coiled-coil和IQ结构域。 第二部分，对NUP98-IQCG融合蛋白致白血病的分子机制进行了初步的探讨。1.研究了其对真核细胞转录调控的影响。NUP98-IQCG融合蛋白在用pBIND-GAL4报告系统分析时表现出较强的反式激活特性。体外蛋白结合试验(GSTpull-down)也证实该融合蛋白可与核内转录共激活物结合，并且是通过NUP98部分的FG重复片段起作用的。值得注意的是，GSTpull-down试验也检测到该融合蛋白与核内转录共抑制物的结合。NUP98-IQCG融合蛋白可能干扰了细胞的转录调控机制。2.研究了NUP98-IQCG融合蛋白在细胞定位的变化。野生型的NUP98定位于核膜及核内，野生型的IQCG定位于胞浆，而NUP98-IQCG主要定位于核内。当NUP98-IQCG与IQCG共转染时，IQCG与NUP98-IQCG在核内有共定位。GSTpull-down试验证明了NUP98-IQCG可形成同源二聚体，与NUP98或IQCG形成异源二聚体。这些蛋白质间的相互作用可能导致了IQCG部分进入到核内。尽管IQCG在核内所起的作用尚不清楚，但与所有的NUP98-非同源盒融合基因一致，NUP98-IQCG中也保留了coiled-coil结构域，其可促进与转录因子或辅助因子的结合，可能参与对下游靶基因的调控。 为了研究NUP98-IQCG融合蛋白在细胞水平上的生物学行为，构建了稳定表达NUP98-IQCG的细胞株：32Dcl3-NUP98-IQCG/32Dcl3-EV和HL60-NUP98-IQCG/HL60-EV。结果显示NUP98-IQCG能阻滞rhG-CSF诱导的32Dcl3细胞向成熟粒细胞的分化；还能抵抗Ara-C(cytarabine)诱导的凋亡，在HL60细胞株中能耐受去除血清对细胞增殖的抑制作用；但NUP98-IQCG也抑制细胞增殖。这些结果提示NUP98-IQCG可能主要通过抑制细胞分化、促进细胞生存及阻滞细胞凋亡而在白血病的发生中起重要作用。 根据急性髓细胞白血病发病机制的“多次打击学说”的提示，在该患者样本中筛查了FLT3、c-KIT、ABL、PDGFRα及PDGFRβ等基因的核苷酸序列，但未在这些基因中检测到异常突变。因此，此染色体易位有可能通过NUP98-IQCG融合蛋白以及NUP98、IQCG的受累从而在白血病的发病中起作用。

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文摘

英文文摘

声明

第一部分急性T／髓细胞性白血病中NUP98-IQCG融合基因的克隆

引言

材料与方法

结果

讨论

第二部分NUP98-IQCG融合蛋白致白血病机制的初步研究

引言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：NUP98在白血病发病机制中的进展

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