78kDa葡萄糖调节蛋白的神经元保护作用研究

摘要

研究背景及目的：近来研究发现内质网功能紊乱引发的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)反应可以导致特异性细胞凋亡,被认为是细胞凋亡的第三条途径.各种影响内质网微环境和功能的刺激可以引发内质网应激,启动未折叠蛋白质反应,促进细胞恢复正常状态.当各种刺激超出了细胞处理能力,ERS将导致细胞凋亡.目前对ERS凋亡途径研究了解不多,其中caspase-12被认为是ERS凋亡途径中的一种特异性凋亡介质,其只能被ERS刺激激活并可以介导线粒体非依赖性的细胞凋亡.而78kDa糖调节蛋白(Glucose RegulatedProtein 78kDa,GRP78)是内质网中最重要的分子伴侣之一,作为一种应激反应蛋白,在辅助蛋白质折叠、稳定ER中Ca<'2+>水平、调节ERS跨膜信号感受器活性方面具有重要作用,显示出细胞保护的潜在作用,但是目前还缺乏GRP78细胞保护作用尤其是抵抗ERS所致凋亡方面的直接证据和机制研究. 研究显示脑缺血再灌注后, Ca<'2+>ER耗竭、蛋白质沉积、蛋白质降解障碍、ER及Golgi体中脂质过氧化物聚积等可引发神经元ERS的多种因素并存,研究干预脑缺血后ERS诱导的神经元凋亡可以为脑血管疾病的治疗提供新的方向和依据.本研究将采用原代海马神经元缺糖缺氧(Oxygen-Glucose Deprivation,OGD)损伤模型作为缺血性神经元损伤ERS途径研究的基础,应用2脱氧葡萄糖诱导GRP78表达结合RNAi封闭GRP78表达,提供GRP78神经元保护作用的直接证据,并深入探讨GRP78的保护作用与ERS特异性凋亡介质caspase-12间的关系和分子机制. 方法：首先进行大鼠海马神经元原代无血清培养,通过荧光免疫双标染色鉴定原代海马神经元纯度、生长特点,然后建立原代海马神经元OGD损伤模型,TUNEL法及改良MTT(CCK8)法鉴定OGD模型发生神经元凋亡的时间窗特点,确定凋亡发生率最高的时间点,作为后续缺血性神经元凋亡的ERS途径研究的基础.应用RT-PCR和免疫杂交印记 (western blot) 鉴定10mM 2-脱氧葡萄糖对GRP78的诱导作用以及设计合成的GRP78siRNA封闭其表达作用,CCK8鉴定毒性.TUNEL法比较诱导及抑制GRP78表达对OGD后神经元凋亡率的影响,western blot检测不同GRP78水平对OGD后caspase-12、m-calpain及IRE1活化水平的影响. 结果：随OGD作用时间在0.5～3h间延长,OGD后6h、24h、48h各时间点细胞活力进行性下降,3h OGD后的48h时细胞活力仅为12.16﹪±3.76﹪.OGD2h后24h时间点处细胞凋亡率最大,达63.15﹪±4.85﹪.10mM 2-DG孵育细胞24h后GRP78的mRNA和蛋白质水平分别为对照组的3.35±0.62倍和3.17±0.46倍,无细胞毒性.而设计合成的GRP78siRNA可以抑制GRP78表达,RNAi后24h时GRP78的mRNA和蛋白质水平分别为对照组的37.28﹪±8.67﹪和42.48﹪±7.66﹪,对HSP70表达无影响.诱导GRP78表达,使2hOGD后24h时细胞凋亡率降为33.64﹪±7.34﹪,伴随切割活化的caspase-12、m-calpain及IRE1蛋白质水平分别下降为OGD对照组的0.42±0.15倍、0.63±0.08倍和0.31±0.06倍；RNAi抑制GRP78表达,使2hOGD后24h时细胞凋亡率升高至78.36﹪±7.61﹪,伴随切割活化的caspase-12、m-calpain及IRE1蛋白质水平分别升高为OGD对照组的2.13±0.28倍、1.42±0.21倍和2.76±0.32倍。 结论：无血清原代培养海马神经元OGD作用2小时,恢复24小时,细胞凋亡发生率最高；ERS是原代海马神经元OGD损伤的病理机制之一；GRP78具有保护缺血损伤神经元、抵抗凋亡的作用；GRP78通过抑制m-calpain和IREl激活从而阻断ERS的特异性凋亡介质caspase-12活化,减少神经元凋亡。

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文摘

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前言

第一章原代海马神经元培养与缺血性神经元损伤

引言

第一节原代海马神经元培养与鉴定

材料与方法

结果

讨论

第二节缺血再灌注神经元损伤细胞模型及其损伤特点

材料与方法

结果

讨论

小结

第二章GRP78对缺血再灌注神经元凋亡的作用研究

引言

第一节GRP78对原代海马神经元OGD/恢复后细胞凋亡的影响

材料与方法

结果

讨论

第二节GRP78细胞保护作用的Caspase-12相关机制

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

内质网应激与细胞凋亡

致 谢

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