人骨髓基质干细胞和脱钙骨复合物体外保存的实验研究

摘要

随着组织工程骨产品的开发和临床应用,其保存方法也逐渐受到重视。为了缩短工程化骨构建、运输到应用的周期,尽快提供骨缺损病人继续的骨替代产品,满足组织工程骨产业化需要的大批量产品供临床使用,必须解决组织工程骨保存问题。有效的保存对于组织工程骨产业化、商品化有着重要的意义。
　　 根据保存温度的不同,保存方式可以分为常温保存和低温保存。对于有活性的组织工程产品,在其保存期间应尽量降低甚至关闭所有的生化反应。温度是控制生化反应的重要因素,降低储存温度可以极大地抑制细胞和组织内各种酶的活性减缓各种生化反应的进行。常温保存温度躲在零上,目前使用较多的是4℃。4℃条件下,细胞内外仅存有少量生化反应,临床主要应用于短时间内保存组织和器官。而37℃是大多数哺乳动物细胞维持活性和分化的最适温度,在此温度下,细胞增殖、分化比较旺盛,酶活性、生化反应都维持在较高水平。
　　 低温保存的温度多在零下,常见的有-20～-40℃冰箱保存、-60～-80℃深低温冰箱和液氮(-196℃)超低温保存等。本研究中使用的是-196℃。理论上在该温度是活体细胞和组织保存的最佳温度,细胞内外的反应都会终止。传统的慢速降温和现在流行的玻璃化都可以实现-196℃深低温冻存。传统的慢速降温冷却法,冷冻过程中影响因素较多,操作复杂费时,难以推广使用；同时冷冻和复苏过程中会产生所谓的冰晶损伤和溶液损伤,不仅会对细胞膜的通透性造成损伤导致细胞溶解凋亡,还会损伤细胞间连接结构,对所保存的细胞和组织活性造成很大影响,大大地限制了其在临床上的应用。
　　 玻璃化保存(vitrification)是一种超速冷冻方法,它是以极快的速度冷冻细胞,使细胞内外的游离水迅速形成玻璃样物质,而不形成冰晶。这种保存方法既避免了由于慢速降温时导致的盐浓度升高,又防止了由于冰晶形成造成的物理损伤,可获得较高存活率。
　　 玻璃化液(vitrification solution)是指可以促使玻璃化形成,保护细胞免受冷冻损伤的物质(常为溶液)。玻璃化液对于玻璃化成功与否有着至关重要的作用。不同的玻璃化液有不同的优缺点,随着不同种类细胞玻璃化液也有很大差异,对细胞的存活率有着很大的影响。目前少有关于不同玻璃化液对于细胞影响的报道。
　　 目前关于研究组织工程产品在37℃、4℃保存以及玻璃化保存的研究较少。仅有少量报道涉及组织工程皮肤、软骨的4℃保存和组织工程化血管和胰腺的玻璃化。尚未见关于组织工程骨37℃、4℃保存以及在保存条件下活性、代谢以及成骨分化的报道,组织工程骨玻璃化保存以及玻璃化溶液也鲜有报道。本实验对比研究了组织工程骨37℃、4℃保存、玻璃化和常规冻存,就组织工程骨的保存进行了一部分探索性的研究。
　　 目的:
　　 1.研究37℃、4℃密封保存对人骨髓基质干细胞(hBMSCs)和人脱钙骨(DBM)复合物细胞活性、增殖和体内外成骨能力的影响。
　　 2.研究玻璃化和常规冻存对人骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物细胞活性、增殖和体外成骨分化能力的影响。
　　 3.初步探讨适合人骨髓基质干细胞和人成纤维细胞玻璃化的溶液。
　　 材料和方法：
　　 1.取3例志愿者骨髓(3～5ml),密度梯度离心、差速贴壁法获得BMSCs。按4×4×4mm3规格制备人脱钙骨,使用第四代细胞与材料复合,每块接种4×104个细胞,体外培养1周,转移至15ml离心管中密封培养,每管中加入5ml新鲜成骨诱导液,使用Hoechst33258分别至于4℃冰箱和37℃培养箱中。保存时间设定为5、7、9、11天。同时以未保存的复合物为对照组。使用Hoechst33258检测材料上细胞增殖,测定培养基中葡萄糖(Glucose)、乳酸(lactate acid)、氨离子(NH4+)含量观察细胞在密封条件下的代谢,通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量观察细胞成骨分化能力。同时引入比速率的概念描述单个细胞活力和成骨分化能力。最后将保存后的复合物回植裸鼠皮下,4周取材,行Micro-CT检测,H&E染色,组织学观察。
　　 2.选用第四代人骨髓基质干细胞与4×4×2mm3规格的人脱钙骨复合,每块材料接种4×104个细胞,体外成骨诱导液培养1周,按玻璃化和常规冻存方案进行低温保存,时间设定为7天和3月,同时以未保存的复合物为对照组。使用共聚焦显微镜(confocal)和扫描电镜(SEM)观察冻存前后细胞存活情况以及细胞在材料上粘附、形态学的改变,使用Hoechst33258检测材料上细胞增殖,通过测定碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)含量以及比生成速率观察细胞体外成骨分化能力。
　　 3.选取第三代的人骨髓基质干细胞和人成纤维细胞,分别制备1.5×104/ml单细胞悬液1ml,与1ml玻璃液混合,玻璃化保存7天后取出,使用台盼蓝检测细胞存活率,于1、3、5、7、10、12、14天Hoechst33258检测材料上细胞增殖。
　　 结果：
　　 1.37℃密封条件下,在保存5～7天内,细胞数量保持在1.3×105左右,细胞的活性、代谢、成骨能力都与对照组相似,维持在较高水平,7天之后细胞数目、活性以及成骨分化能力开始出现下降。4℃条件下,细胞增殖、成骨分化都处于较低水平,细胞处于“冬眠”状态。Micro-CT和组织学观察发现37℃保存5天、7天的复合物中有大量骨样细胞出现,同时伴有新鲜骨基质形成。4℃条件下无新生骨生成。
　　 2.7天冻存后,玻璃化和常规冻存复合物细胞存活率分别为79.6±1.45％和83.1±1.2％,两者无统计学差异。3月冻存后两者的细胞存活率为77.8±0.8％和81.6±1.3％,亦无统计学差异。两种冻存对细胞增殖和体外成骨分化能力亦无明显影响,而且长期和短期玻璃化、常规冻存对细胞存活率和增殖亦无明显影响。
　　 3.使用玻璃化溶液D、E之后细胞存活率相对最高,分别达到了85±1.8％和83±2.6％。细胞的增殖未受明显影响。
　　 结论：
　　 1.37℃密封条件下,在5～7天内,人骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物在5ml成骨诱导液中可以维持与对照组复合物相似的细胞的活性、代谢、成骨分化能力。4℃密封条件下,11天内,人骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物中细胞的活性、代谢和成骨分化都维持在较低的水平,可能并不适合组织工程骨体外保存。
　　 2.玻璃化保存对复合物细胞存活率、增殖和成骨分化的影响与常规冻存相似,长期和短期玻璃化影响亦无明显区别。
　　 3.玻璃化溶液D、E可以作为人骨髓基质干细胞和人成纤维细胞玻璃化溶液使用,具有良好的细胞存活率和增殖活性,其对细胞定向分化能力以及长期作用有待进一步实验研究。

目录

文摘

英文文摘

缩略词表

引言

第一章 37℃、4℃保存对人骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物活性、代谢及成骨能力影响的对比研究

材料和方法

结果

讨论

本章小结

参考文献

第二章 玻璃化和慢速冻存对人骨髓基质干细胞和人脱钙骨复合物活性、代谢及成骨能力影响的对比研究

材料和方法

结果

讨论

本章小结

参考文献

第三章 不同玻璃化溶液对人骨髓基质千细胞和成纤维细胞存活率、增殖的影响

材料和方法

结果

讨论

本章小结

参考文献

全文结论

致谢

综述

参考文献

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