新生小鼠轮状病毒腹泻病理学及分子生物学致病机制研究

摘要

目的：轮状病毒(Rotavirus，RV)感染性腹泻的病理生理学机制尚没有完全明了。目前认为腹泻发生与肠病理改变并没有绝对的相关性，轮状病毒非结构蛋白4(NSP4)及肠神经系统(ENS)可能同时参与致病，其中ENS被认为是病毒及NSP4发挥作用的重要途径，而病毒及NSP4作用和激活ENS途径及其关键的效应分子有待进一步阐明。NO是一种重要的胃肠神经递质，在胃肠的生理和病理中发挥重要的递质、信使和调节因子的功能。在轮状病毒感染中，轮状病毒及NSP4作用绒毛上皮细胞，可能激活致肠黏膜上皮细胞NOS，导致NO大量生成，从而激活ENS中的NO神经元。本研究第一部分旨在探讨轮状病毒的培养条件，为成功建立动物模型奠定基础；第二部分通过建立新生昆明鼠RV腹泻模型，观察肠黏膜病理变化与临床腹泻关系：第三部分研究腹泻中肠黏膜iNOS表达变化，阐明NO在腹泻发生中的重要作用。 方法：1.第一部分：用于病毒增殖和测定的培养细胞为非洲绿猴肾传代细胞CV-1℃V-1细胞在含10％胎牛血清，2mmol/L谷氨酰胺的MEMEagle’s培养液培养液中生长和传代。SA11株的增殖和滴度测定在CV-1上进行，当细胞在培养瓶中生长至单层时，接种用胰酶处理的RV，接种病毒后的细胞维持液为无胎牛血清，然后用反复冻融方法收毒，再采用TCID50法计算病毒滴度。2.第二部分：50只3d昆明鼠按接种RV与否随机分为实验组(40只)与对照组(10只)，实验组经胃灌入0.2ml(2×108PFU)含病毒培养液，对照组灌入0.2ml不含病毒的培养液，分别于接种后不同时间点观察腹泻情况，ELISA方法检测粪便RV抗原，并取其肠黏膜光镜观察形态学变化及电子显微镜下观察RV定植及细胞超微改变。3.第三部分：48只3d新生昆明鼠按接种RV与否随机分为实验组(32只)与对照组(16只)，接种过程同第二部分，在不同时间观察腹泻情况，取肠黏膜光镜下观察形态学变化，实时荧光PCR检测iNOS表达变化。 结果：1.第一部分：CV-1细胞在接种病毒后，24hr开始出现病变，细胞空泡化、圆缩，先灶状脱落，再大片脱落，最后整个细胞裂解、破碎，72hr约达到80％病变，相当于108PFU/ml。2.第二部分：实验组接种SA11株后24小时均出现腹泻，在接种后4天达高峰，第10天完全恢复正常，10天后体重开始增长，速率同对照组，粪便ELISA检测RV抗原均为阳性结果。突出的病理改变为小肠上皮细胞广泛空泡样变性，增生、坏死、绒毛萎缩脱落改变不明显，隐窝细胞未发生变化，未见隐窝细胞延长，炎症改变轻微，以空肠病变最为明显，病变程度与腹泻发生程度一致。电镜下肠上皮细胞见RV病毒，并发现有吞噬小体，溶酶体增多，线粒体肿胀，空泡变，但绒毛上皮刷状缘结构完整，未见绒毛脱落现象，紧密连接疏松、增宽，完整性受到破坏。3.第三部分：随着腹泻及病理改变的加重，iNOSmRNA的表达进一步升高，于第四天达高峰，其后表达量降低，第10天降至最低，新生鼠肠iNOSmRNA的表达变化趋势与病理变化及腹泻发生程度基本一致。 结论：1.第一部分：CV-1细胞对SA11株敏感，可作为SA11株的培养细胞，用于病毒培养增殖，胰酶浓度是培养的关键。2.第二部分：新生昆明鼠对SA11株是敏感的，可作为RV感染致病机制、评价RV感染药物治疗和疫苗保护效果的动物模型。RV主要感染小肠成熟绒毛上皮细胞，其病理改变轻微，仅显示空泡变性，表明RV腹泻与绒毛萎缩坏死脱落关系不大；RV腹泻的发生可能是通过破坏肠上皮细胞间连接关系，改变上皮细胞极化从而影响水电解质平衡的；与微绒毛损害、细胞凋亡脱落、绒毛萎缩及隐窝细胞取代关系不大。3.第三部分：NO作为一种神经递质，在介导RV腹泻发生发挥重要作用，是RV腹泻发病机制的重要因子。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一部分轮状病毒体外培养与增殖

第二部分新生小鼠轮状病毒感染模型及其病理学致病机制研究

第三部分新生小鼠轮状病毒腹泻iNOSmRNA的表达及其意义

结论

参考文献

致谢

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