组织工程化软骨基质组成、结构及力学性能的相关研究

摘要

软骨组织由于自身修复能力弱，其缺损修复一直是目前临床治疗的一大难题。组织工程软骨的研究为修复关节软骨的病变开辟了新途径，目前已有在体外成功构建组织工程化软骨，并修复动物体内关节软骨缺损的文献报道。但是软骨组织工程的优势和最终目的是在体外构建具有良好生物功能的软骨，实现产业化生产以造福更多患者。在组织工程软骨进入生产产业化和大规律临床使用之前，很多关键问题尚未解决，其中主要的问题有：1.组织工程化人工软骨与正常人软骨在生化结构和力学性能上有何异同点，其形成过程与转归与正常软骨发育过程是否相似?2.在体外形成人工软骨是否能最终达到临床所需的力学性能，其结构基础是什么?3.体内外微环境及力学刺激对于人组织工程软骨组织生化结构和力学性能的影响如何?这些基本理论都是在进入临床实践与组织工程软骨产业化之前需解决的问题，且目前未见这些问题的系统文献报道。
　　 带着上述问题，我们应用组织工程技术建立了一系列体内外实验，主要研究体内、体外形成的组织工程化软骨力学性能及其与基质组成、结构的相关性，比较其与正常软骨组织在形态和功能上的差距，并深入探讨了体外构建软骨力学性能较弱的生化结构基础和改善要点，主要内容包括以下几方面：
　　 1.体内外环境对人组织工程化软骨力学特性的影响
　　 方法收获流产后人胚胎软骨细胞，在体外扩增后接种第二代细胞于聚羟基乙酸/聚乳酸(Polyglycolic acid/Polylactic acid，PGA/PLA)材料上，构建四周后分为体内、体外两组。分别于分组6周和12周后取材并进行大体观察、组织学和力学性能检测，并与正常软骨相比较。结果利用第二代人胚胎软骨细胞体外构建组织工程软骨后，能在体内外均形成透明软骨组织。体内植入软骨12周后软骨外观近似天然成人软骨，压缩弹性模量达到成人关节软骨的84％；而体外形成的软骨，外观类似胎儿软骨，弹性模量仅为正常成人的7.3％。小结人组织工程软骨体外构建后植入动物体内能促进其形态和功能的成熟，体现了从幼稚软骨到成熟软骨转变过程，类似正常胎儿软骨发育。体内外环境中形成的组织工程软骨力学性能有显著性差异。
　　 2.组织工程化软骨力学性能的生化结构基础
　　 方法体外构建人组织工程软骨并分别在体内外培育，取材后进行组织学、细胞外基质成分定量分析、电镜观察等检测，比较体内外人工软骨及天然软骨在基质组成、结构上的差异，最后做力学性能与各特异性基质成分的相关性分析。结果体外形成的人工软骨在基质组成、结构上与体内形成软骨及天然软骨差异显著，而体内植入12周后的人工软骨从超微结构、ECM含量及基因表达方面均接近成人软骨。各种定量检测中，总胶原含量、Ⅸ型胶原含量、交联吡啶诺林(Pyridinoline，PYR)含量、胶原直径与力学性能的变化显著相关(p＜0.05)。小结体外组织工程软骨抗压力学性能不足的结构基础主要是软骨中总胶原含量、IX型胶原及胶原交联含量不足从而导致胶原纤维结构异常。其中PYR和Ⅸ型胶原含量不足以有效联结胶原分子形成粗大胶原纤维可能是最重要的机制。
　　 3.体外力学刺激对组织工程化软骨结构和力学特性的影响
　　 方法将人软骨细胞-材料复合物分为体外离心培养、体外静态培养组，6周后观察两实验组成软骨情况，并检测力学性能及与力学性能相关指标的变化。结果体外构建的人工软骨在规律离心力持续作用6周后，力学性能明显增强(p＜0.01)，同时可见各型胶原蛋白基因表达增强，总胶原含量、IX型胶原含量及PYR含量等都较静态培养组高(p＜0.01)。透射电镜下胶原纤维较静态培养组连接更为纤长和紧致，近似胎儿关节软骨。小结离心力刺激能通过增加与力学性能密切相关的总胶原、IX型胶原及PYR等细胞外基质的合成，改善其胶原纤维结构，最终促进体外培养工程化软骨的力学性能。
　　 综上所述，本研究结果明确人组织工程化软骨与正常人软骨在形成过程、结构与功能的异同处，阐明体内外环境和力学刺激对组织工程化软骨基质组成、结构及力学性能的影响，详尽探讨了体外组织工程化软骨力学性能较弱的结构基础。这些问题的解决将有助于指导和优化体外构建技术，改善体外形成的组织工程化软骨结构和生物功能，为阐明组织工程化软骨的形成机制与转归，最终实现软骨组织工程的产业化和临床应用提供理论依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词说明

声明

绪论

第一章体内外环境对人组织工程化软骨力学特性的影响

前言

第一节人胎儿关节软骨细胞体外分离、培养和扩增的实验研究

1.1.1引言

1.1.2材料与方法

1.1.3实验结果

1.1.4讨论

第二节体内外环境对人组织工程化软骨力学特性的影响

1.2.1引言

1.2.2材料与方法

1.2.3实验结果

1.2.4讨论

1.3本章小结

第二章组织工程化软骨力学性能的生化结构基础

2.1引言

2.2材料与方法

2.3实验结果

2.4讨论

2.5本章小结

第三章离心培养对体外构建组织工程化软骨结构和功能的影响

3.1引言

3.2材料与方法

3.3实验结果

3.4讨论

3.5本章小结

参考文献

全文结论

致谢

攻读博士学位期间发表论文