miRNA参与调控人舌鳞癌细胞顺铂耐药性的研究

摘要

研究目的
　　 MicroRNA(miRNA)是一类具有调控功能的非编码单链小分子RNA,通过核酸序列的互补性结合到特定的靶信使RNA(mRNA)上调节翻译或是降解靶mRNA来调控基因表达。miRNA调节了多种生物学信号通路,最近的研究发现,miRNA的表达与多种人类的肿瘤相关,大约50％得到注解的miRNAs在基因组上定位于肿瘤相关的脆性位点,提示miRNA在肿瘤发生过程中起到了至关重要的作用。恶性肿瘤的对化疗药物产生耐药性是导致化学治疗(化疗)失败的重要因为,有研究表明miRNA水平的改变有可能导致肿瘤对化疗敏感性的变化。本研究对人舌鳞癌细胞系顺铂耐药模型Tca8113/CDDP中miRNA表达谱进行检测,并对其中部分差异表达的miRNA能否逆转肿瘤的耐药性进行深入研究,拟阐明miRNA在参与调控人舌鳞癌顺铂耐药机制中可能发挥的作用,为逆转临床耐药、提高化疗效果提供新的思路。
　　 研究方法
　　 1.应用miRNA表达谱芯片对人舌鳞癌细胞系Tca8113及其顺铂耐药模型Tca8113/CDDP中miRNA表达谱进行检测,筛选出人舌鳞癌细胞顺铂耐药相关的miRNA。
　　 2.应用miRNA的荧光实时定量PCR(real-time PCR)方法对miRNA表达谱芯片筛选出的差异表达miRNA进行体外验证。
　　 3.对miRNA芯片检测出的在Tca8113/CDDP细胞中表达明显上调并经real-time PCR方法验证的部分miRNAs,应用化学合成法合成miRNA抑制剂(miRNA inhibitor),转染至Tca8113/CDDP细胞中,观察其对肿瘤细胞耐药性的影响；这些miRNA包括mir-23a,mir-30d,mir-214和mir-432。
　　 4.对miRNA芯片检测出在Tca8113/CDDP细胞中表达明显下调并经real-time PCR方法验证的mir-21,构建质粒,转染至Tca8113/CDDP细胞中,观察其对改变肿瘤细胞耐药性的影响。
　　 研究结果
　　 1.应用miRNA表达谱芯片共检测出差异表达miRNA19条,其中在Tca8113/CDDP中上调的miRNA为17条,包括let-7,mir-20b,mir-23a,mir30d,mir-214,mir-181d,mir-188和mir-432等；在Tca8113/CDDP中下调的miRNA为2条,包括mir-21和mir-342。
　　 2.应用real-time PCR方法对芯片检测出的19条miRNA在Tca8113细胞和Tca8113/CDDP细胞中表达进行验证,结果其中14条miRNA的表达与芯片的检测结果一致。
　　 3.化学合成mir-23a、mir-30d、mir-214以及mir-432的miRNAinhibitor,应用脂质体瞬时转染法将miRNA inhibitor转染至Tca8113/CDDP细胞中,应用real-time PCR方法检测细胞中miRNA的表达水平,发现均有不同程度的表达下调,表明miRNA inhibitor已成功转染至细胞内。应用MTT法检测转染miRNA inhibitor后Tca8113/CDDP对顺铂耐药性的变化,发现转染mir-23a inhibitor和mir-214 inhibitor能够不同程度地逆转细胞对顺铂的耐药性。而转染mir-30d inhibitot-和mir-432 inhibitor的细胞对顺铂的耐药性无明显变化。
　　 4.构建质粒pGenesil-1.1/pre-mir-21,转染至Tca8113/CDDP细胞中,经药物筛选得到稳定转染的细胞,荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白EGFP的表达,表明质粒已成功转染至细胞内。应用MTT法检测质粒转染后细胞对顺铂耐药性的变化,发现转染后的细胞对顺铂的耐药性发生了变化,pGenesil-1.1/pre-mir-21能够部分地逆转肿瘤细胞对顺铂的耐药性。
　　 结论
　　 1.与人舌鳞癌细胞系Tca8113相比较,其顺铂耐药模型Tca8113/CDDP细胞中miRNA的表达谱发生了变化,提示miRNA可能在人舌鳞状细胞癌对顺铂耐药的机制中发挥了重要作用；同时这些异常表达的miRNA有可能成为肿瘤细胞是否发生耐药的生物标志。
　　 2.Real-time PCR方法能够灵敏地检测细胞中miRNA表达水平的变化。
　　 3.化学合成的mir-23a,mir-30d,mir-214和mir-432 inhibitor能够有效地降低这些miRNA在细胞内的表达水平；下调mir-23a,和mir-214的表达水平能够部分地逆转Tca8113/CDDP细胞对顺铂的耐药性。
　　 4.成功构建了质粒pGenesil-1.1/pre-mir-21,筛选出稳定表达该质粒的Tca8113/CDDP细胞；转染质粒后的细胞中mir-21的表达水平上调；转染质粒后的细胞对顺铂的耐药性发生变化,上调mir-21的表达水平能够部分地逆转Tca8113/CDDP细胞对顺铂的耐药性。

目录

文摘

英文文摘

符号说明表

前言

第一部分 人舌鳞癌细胞系顺铂耐药模型Tca8113/CDDP miRNA表达谱检测

实验一 Tca8113/CDDP miRNA表达谱检测

1.1.1 实验材料

1.1.2 实验方法

1.1.3 实验结果

1.1.4 讨论

实验二Tca8113/CDDP miRNA表达谱验证

1.2.1 实验材料

1.2.2 实验方法

1.2.3 实验结果

1.2.4 讨论

第二部分 mir-23a,mir-30d,mir-214和mir-432在Tca8113/CDDP中的功能研究

实验一 mir-23a在Tca8113/CDDP中的功能研究

2.1.1 实验材料

2.1.2 实验方法

2.1.3 实验结果

2.1.4 讨论

实验二 mir-30d在Tca8113/CDDP中的功能研究

2.2.1 实验材料

2.2.2 实验方法

2.2.3 实验结果

2.2.4 讨论

实验三 mir-214在Tca8113/CDDP 中的功能研究

2.3.1 实验材料

2.3.2 实验方法

2.3.3 实验结果

2.3.4 讨论

实验四 mir-432在Tca8113/CDDP中的功能研究

2.4.1 实验材料

2.4.2 实验方法

2.4.3 实验结果

2.4.4 讨论

第三部分 mir-21质粒构建及其在Tca8113/CDDP中的功能研究

实验一pGenesil-1.1/pre-mir-21质粒构建

3.1.1 实验材料

3.1.2 实验方法

3.1.3 实验结果

3.1.4 讨论

实验二pGenesil-1.1/pre-mir-21在Tca8113/CDDP中的功能研究

3.2.1 实验材料

3.2.2 实验方法

3.2.3 实验结果

3.2.4 讨论

全文总结

参考文献

致谢

发表论文及承担课题