真核生物胞质伴侣素6A及其相关通路在结直肠肿瘤细胞迁徙、侵袭中作用机制的研究

摘要

目的：结直肠癌是近几年发病率增长最快的恶性肿瘤之一，肿瘤的局部浸润及远处转移是影响预后的重要因素之一。因此，寻求具有较高特异性和灵敏度的肿瘤转移预测因子，对于早期发现肿瘤及个体治疗都有积极的意义。随着不断深入研究，最近一项关于乳腺癌细胞的研究表明，PLK-1可通过PLK-1—波形蛋白—表面整合素β1 这一通路促进肿瘤的浸润和转移，而CCT 已被证实为PLK-1 的上游蛋白。因此本研究首先比较相关蛋白在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达情况并分析VIM 的表达与结直肠癌临床特征的关系，进而通过一系列试验验证这条通路在结直肠癌浸润中的作用机制。
　　 方法：⑴以56例明确诊断为结肠直肠癌患者的石蜡包埋组织样本为原料制作组织芯片并用免疫组化方法检测相关蛋白的表达，分析其表达与病人临床病理之间的关系。⑵用普通PCR 和Western 印迹法检测9株结直肠癌细胞株中相关蛋白的表达并筛选表达量较高的细胞株。⑶设计合成针对各靶蛋白的siRNA 并筛选最有效的干扰序列。⑷用CCK8试剂盒测沉默各基因表达前后结直肠癌细胞增殖能力改变。⑸通过Transwell 小室试验检测沉默各基因表达前后结直肠癌细胞迁移和浸润能力的改变情况。⑹利用流式细胞仪检测细胞周期及细胞表面整合素β1的表达率，以及利用westen-blot 检测下调PLK-1 后VIM s82 磷酸化表达情况。
　　 结果：①结肠直肠癌组织中CCT6A、PLK-1 及VIM 的表达明显高于结肠直肠正常组织，具有显著性差异（P＜0.05）。其中VIM 的表达与肿瘤大小、淋巴结转移（P＜0.05）相关，和结直肠癌患者的年龄、性别、肿瘤分化程度、肿瘤部位、浸润深度，远处转移无关。②9株结直肠癌细胞株中SW1116 细胞中各基因表达量均相对较高。③成功下调SW1116 细胞中VIM 的表达。干扰片段对VIM 基因的抑制率达到72％，且经过western-blot 验证蛋白水平也受到抑制。④下调3 种蛋白表达后，在转然后48h 起，SW1116 细胞增殖明显受到抑制，各组间差异有统计学意义（P＜0.05），NC 组及MOCK 组间差异无统计学意义。⑤迁移试验结果显示，siRNA 处理组迁移细胞数目均低于NC 组和Liposome 组（P＜0.05）而NC 组和Liposome 组间的差异均无统计学意义。⑥浸润试验结果显示，siRNA 处理组浸润细胞数目均低于NC 组和Liposome 组（P＜0.05）而NC 组和Liposome 组间的差异均无统计学意义。⑦流式细胞仪检测细胞周期结果显示，CCT6A 干扰组及PLK-1 干扰组中细胞G2/M期比例显著高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），而两者之间差异无统计学意义。⑧流式细胞仪检测细胞表面整合素β1 表达率结果显示，下调各蛋白表达均能使整合素表达率上升，与对照组差异有统计学意义（P＜0.05），而且各蛋白间无叠加效应。⑨western-blot 结果显示下调PLK-1 的表达能抑制VIM s82 磷酸化。
　　 结论：⑴VIM在结直肠癌中高表达，并且和结直肠癌肿块大小和淋巴转移相关，有可能成为一种新的结直肠癌预测转移的指标。⑵针对VIM 的siRNA 片段作用于结直肠癌细胞株SW1116 可下调VIM的表达，同时抑制细胞的增殖、迁移和浸润能力。⑶“CCT6A-PLK1-VIM-Integrinβ1”这条通路在结直肠癌浸润过程中起到一定作用。PLK-1 通过磷酸化VIM 第82 位丝氨酸调控其功能。⑷结直肠癌细胞株表面整合素β1的表达率与细胞运动能力不呈正相关，有待进一步研究。

目录

引 言

第三部分 相关通路在结直肠癌细胞株中的初步验证

结 论

参考文献

致 谢

已发表文献

论文说明:缩略语表

声明