L-asparaginase抗髓系白血病作用机制及ASNS细胞定位的研究

摘要

自引入了左旋门冬酰胺酶(L-Asp)后，儿童急性淋巴细胞白血病(ALL)的完全缓解率、长期无病生存率都得到明显的提高，作为儿童ALL化疗方案中的一线药物，L-Asp在维持ALL患儿持续完全缓解中有着不可替代的地位。目前，L-Asp在髓系白血病治疗中仍未被作为常规化疗药物使用。既往认为髓系白血病较之于淋系白血病对L-Asp的敏感性低，从而限制了其在其它类型白血病中的临床应用。最近有观点认为，L-Asp对某些亚型的急性髓系白血病(AML)也有良好的治疗效果。目前，已经有研究通过细胞系和临床原代细胞实验研究验证了该假设的真实性。我们在前期工作中也发现，具有单核细胞白血病特征的髓系细胞株U937对L-Asp极为敏感，同时L-Asp能诱导其发生凋亡。因此，L-Asp可能在AML治疗上有着很好的应用前景，值得我们对其抗肿瘤机制作深层次的探讨。
　　 L-Asp的作用机制是分解血浆中的门冬酰胺和谷氨酰胺，通过耗竭细胞内门冬酰胺，使其蛋白质生物合成障碍，最终细胞死亡。门冬酰胺合成酶(ASNS)的作用则与之相反。幼稚淋巴细胞内ASNS活性增高可能是L-Asp的耐药机制之一。到目前为止，有关ASNS与L-Asp耐药相关性的研究一直在不断的探索中，而L-Asp通过调控ASNS细胞定位从而诱导细胞耐药的现象与机制研究至今尚未见相关报道。本研究从ASNS亚细胞定位的层面探讨L-Asp在髓系白血病耐药中的机制，将有助于更深层次以及更全面认识L-Asp的耐药机制，同时也将促进临床个体化治疗以及新药的开发。
　　 研究目的
　　 1.通过检测在L-Asp作用后各细胞凋亡主要通路信号的改变，筛选出在L-Asp诱导髓系白血病细胞凋亡中起关键作用的凋亡途径，初步阐明L-Asp在抗髓系白血病中的作用机制。
　　 2.通过观察ASNS亚细胞定位以及在L-Asp作用后，ASNS细胞内定位的改变，从ASNS亚细胞定位的层面探讨L-Asp的耐药机制，以期为进一步克服耐药寻找有效的方法和途径。
　　 3.建立AIF shRNA稳定转染的U937细胞株，为下一步明确AIF在L-Asp在抗髓系白血病中的作用奠定实验基础。
　　 研究方法
　　 1.凋亡形态学特征鉴定：通过流式细胞术(FCM)检测磷脂酰丝胺酸(PS)外翻；通过DAPI核染色和细胞基因组琼脂糖凝胶电泳观察染色质凝集和DNA降解特征。
　　 2.L-Asp促发细胞凋亡信号转导通路的筛选：
　　 2.1 caspase介导的经典途径：通过Western blot检测关键凋亡蛋白分子caspase-8、cytoC、caspase-9、caspase-3、PARP、bcl-2、bax、GRP-78、HSP90等活化和表达改变；通过FCM检测线粒体跨膜电位(AΨm)和细胞表面Fas表达的改变；用Fas特异性的阻断抗体ZB4阻断Fas通路活化观察对L-Asp诱导细胞凋亡的影响，探讨Fas途径、线粒体途径以及内质网应激途径在L-Asp诱导凋亡中的作用；
　　 2.2 Caspase在细胞凋亡中的作用：利用caspase-8抑制剂z-IETD-fmk、caspase-9抑制剂z-LETD-fmk及caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk阻断caspase通路活化，检测其对L-Asp所致的PS外翻和△Ψm下降的影响，以明确caspase依赖性通路在L-Asp诱导U937凋亡中的作用；
　　 2.3 caspase非依赖性途径：通过Western blot检测AIF在细胞核内的表达改变；通过细胞免疫荧光观察AIF细胞内定位改变以及caspase广谱抑制剂对其核定位的影响，研究AIF在L-Asp促发细胞凋亡中的作用。
　　 3.ASNS的亚细胞定位：将携带有Flag标签的ASNS表达载体pIRES-GFP-Flag-AsnS/Neo质粒分别转染人神经母细胞瘤SK-N-MC细胞株和人胚肾细胞株293T，细胞免疫荧光和Western blot检测外源性ASNS在细胞膜、细胞浆和细胞核中的表达。
　　 4.L-Asp对ASNS亚细胞定位的影响：以杂交瘤细胞制备的ASNS特异性单克隆抗体为一抗，Western blot检测U937细胞在L-Asp作用前后的ASNS亚细胞定位改变。
　　 5.AIF shRNA稳定转染U937细胞的筛选：构建能产生靶向AIF基因的短发夹RNA(shRNA)真核表达质粒，采用稳定转染法，将通过验证的pRNATH1.1-GFP/Neo-AIFshRNA真核表达载体电转染入U937细胞，经G418筛选和GFP流式分选出阳性稳定转染细胞。
　　 研究结果
　　 1.L-Asp诱导U937细胞凋亡：L-Asp处理后，U937细胞出现凋亡，AnnexinV+/PI-早期凋亡细胞和AnnexinV+/PI+晚期凋亡细胞比例呈时间依赖性增高，但这种效应出现时间较晚，在加药后48h明显；核染色质DAPI染色可见明显的凋亡晚期的细胞形态学变化，凋亡细胞的细胞核浓聚，边集和固缩，可见浓染致密的颗粒装荧光；琼脂糖凝胶电泳结果显示，染色质DNA被核酸内切酶降解，产生若干大小不一的多聚核苷酸片段，呈现阶梯状DNA区带图谱(DNA Ladder)。
　　 2.Fas通路不参与L-Asp的诱导凋亡过程：ZB4阻断剂+L-Asp组与单独L-Asp作用组比较，加药48h后的早期凋亡率和晚期凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)；Western blot检测L-Asp加药后Fas下游通路的caspase-8表达没有改变；CD95单抗标记细胞表面Fas的表达从24h的10.91±3.71增加到48h的73.17±10.79(P>0.05)。
　　 3.内质网应激途径不参与L-Asp的诱导凋亡效应：L-Asp作用后GRP78表达无改变。
　　 4.L-Asp通过线粒体途径促发细胞凋亡：FCM分析△Ψm下降与PS外翻时间一致，呈明显时间效应关系；Western blot结果检测到cytoC释放早于△Ψm变化，胞浆中cytoC的表达从加药后3h呈时间依赖性增加；cytoC的释放继而引起caspase-9/caspase-3级联的激活：caspase-9的活化条带p35在加药后24h明显增加，caspase-3酶原从加药后24h减少，表明其发生了剪切活化；caspase-3的作用底物PARP被分解。
　　 5.L-Asp对Bax、Bcl-2和HSP90表达的影响：随L-Asp作用时间的延长，抗凋亡蛋白Bcl-2、前凋亡蛋白Bax以及HSP90表达无明显变化。
　　 6.Caspase抑制剂不能阻断L-Asp的凋亡诱导效应：Caspase抑制剂预处理组与L-Asp单独作用组比较，加药24h和48h后的细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和△Ψm下降(Rh123-细胞百分比)差异无统计学意义(P>0.05)。
　　 7.L-Asp处理后细胞内AIF表达增加并向核内转移：经L-Asp处理后，细胞免疫荧光结果显示，AIF发生程度不等的核转位，可见绿色荧光部分积聚于细胞核中，细胞核移向细胞边缘即核边聚，caspase广谱抑制剂z-VAD-fmk并不能抑制AIF的细胞内易位。Western blot结果检测随L-Asp作用时间的延长，AIF在细胞核内积聚增多；L-Asp可诱导AIF表达上调，细胞总蛋白中AIF表达呈时间依赖性明显增加。
　　 8.ASNS在细胞内的定位：ASNS表达载体pIRES-GFP-Flag-AsnS/Neo质粒瞬时转染SK-N-MC和293T细胞24h后，细胞免疫荧光结果显示ASNS主要位于SK-N-MC细胞的细胞膜表面，Western blot结果显示ASNS表达在转染293T细胞的细胞浆和细胞膜上。
　　 9.L-Asp处理对ASNS细胞内定位的影响：在L-Asp作用48h后，U937细胞膜上的ASNS表达明显增加。
　　 10.G418筛选和GFP流式分选出AIF shRNA稳定转染的U937细胞株，阳性率为93％。
　　 结论
　　 1.L-Asp诱导U937细胞凋亡的分子机制可能是通过耗劫细胞外的门冬酰胺，导致胞内氨基酸营养缺乏，蛋白质代谢障碍，包括线粒体膜上蛋白的代谢障碍，从而引起线粒体外膜的完整性受损，线粒体膜电位发生改变，AIF和cytoC释放，前者直接诱导细胞凋亡而不需要任何辅助因子的参与，后者则通过cytoC/Apaf-1/caspase-9通路执行凋亡。
　　 2.L-Asp引起U937细胞表面的Fas受体明显上调，但Fas/FasL系统并不参与L-Asp促发的凋亡效应。
　　 3.ASNS能够定位在细胞膜上，L-Asp能促进ASNS在细胞膜上的表达。
　　 意义
　　 肿瘤细胞可通过凋亡缺陷而达到保护自身免受化疗药物的作用。本研究初步探讨了L-Asp在抗M5髓系白血病中的作用机制，以此为基础，进一步探讨其它亚型髓系白血病细胞在L-Asp促发凋亡通路上某些关键蛋白或酶类的异常表达和功能改变，对揭示L-Asp致髓系细胞白血病耐药的本质，拓展其在不同类型髓系细胞白血病中的潜在应用有重要意义。ASNS细胞膜定位的首次发现，为L-Asp的耐药机制提供了新的思路和依据，为逆转白血病耐药的药用蛋白开发提供了新的治疗靶点。
　　 然而，L-Asp诱导肿瘤细胞特异性凋亡的确切机制尚不清楚。激活线粒体的一系列上游或旁路信号分子是什么?L-Asp如何整合和调控不同的凋亡信号转导途径?根据L-Asp影响细胞蛋白质合成而发挥抗肿瘤作用的特性，我们假设这些上游信号分子具有以下几个特点：(1)它可能是一个小分子物质，因为当营养缺乏的状态下，细胞通过启动保护性信号途径以减少大分子蛋白质的合成，以利于更多的氨基酸被节省下来维持细胞的存活；(2)它可能是一个转录因子，转录调控促凋亡效应分子的表达；(3)它可能是一个短寿命分子，在应激状态下被迅速激活。
　　 另外，ASNS在细胞膜上执行什么功能?我们推测位于细胞膜上的ASNS可能与氨基酸转运体相互作用，通过增强后者的转运能力而介导L-Asp耐药。下一步通用串联亲和纯化(TAP)技术探讨ASNS的互作蛋白将有助于阐明这些可能机制。
　　 这些假设和问题有待于我们下一步的深入研究。