新型制备型电色谱装置及其在极性小分子物质分离中的应用

摘要

随着生物工程上游技术的迅猛发展,采用分离技术集成化的研究思路开发新型生物分离技术日渐引起学术界重视。将电泳与色谱分离技术进行集成,即在色谱分离过程中引入电场以提高色谱的分离度或分离速度是近年来国内外液相色谱技术的一个重要发展方向。目前,国内外有关制备型电色谱系统的研究工作只有少数课题组进行,这些研究都以蛋白质和核酸等生物大分子为分离对象,使用的固定相主要是分离大分子常用的排阻凝胶、离子交换凝胶和羟基磷灰石等介质。而在生物活性物质中,除了蛋白质等生物大分子外,越来越多的极性小分子活性物质被发现,例如,多肽、多酚、寡核苷酸和水溶性抗生素等。因为极性强,多为水溶性,作为药品具有良好的生物相容性,但却给分离工程师带来难题。目前较成熟的制备技术,例如萃取技术和RP-HPLC(反相高效液相色谱)技术在非极性或弱极性小分子化合物的分离中有良好表现,并且易于放大,但对强极性小分子物质的分离效果很差(例如头孢菌素C和小分子寡核苷酸)。由于大部分强亲水性物质都具有可解离基团,可以用毛细管电泳或电色谱技术进行高效率的分离,但这些方法难以放大,不能制备微克级以上的样品。因此,开发用来分离极性小分子物质的制备型电色谱技术可以为这类物质的分离纯化提供新的制备手段,具有重要的实际意义。本课题在这样的背景下,首次提出并设计了一套适合分离极性或弱极性小分子物质的制备型电色谱装置,建立了各种适合分离或浓缩小分子物质的制备型电色谱技术,并对各种影响因素和分离机理进行了较全面的研究,揭示了通电对色谱分离过程的各种影响。
　　 以柱色谱(40 cm×0.6 cm I.D.,40 cm×1.2 cm I.D.,40 cm×2.0 cmI.D.)为基础设计并构建了制备型电色谱装置,基本解决了电色谱技术放大引起的主要问题,即电解气体进柱和焦耳热累积的问题,确定了装置的结构和实验操作流程。与文献报道的装置类似,在色谱柱两端各连接一个电极室以放置电极溶液和电极；但柱与电极室的连接方式及相对位置与文献报道的不同。文献报道的较成熟的装置都在电极室和柱连接处用排阻膜或凝胶条分隔,电极室的缓冲液和色谱柱的缓冲液分开。这样,用膜或凝胶条可以很好地阻挡电解气体进入色谱柱,同时电极缓冲液与外界循环又可以不断带走气体。由于以大分子样品为分离对象,样品不会穿过膜或凝胶条进入电极缓冲液而造成损失。显然,这些报道的装置不适合可以自由出入排阻膜或凝胶条的小分子物质的分离。本课题的电极室均设计为敞口,将制备型色谱柱的出口电极室改成内径约5 mm的T型三通管,放置在色谱柱侧下方,与柱的支管相连。经过改进的装置可以随时排走电解产生的气泡,不再需要膜或凝胶进行分隔。色谱流出液经过T型三通管电极室后全部进入在线检测器,不必担心小分子样品的泄漏。在冷却系统中,除了用文献报道的色谱柱夹套冷却和进柱缓冲液槽冷却外,还对出口T型电极室和连接管道等焦耳热聚集部位进行了全方位的冷却,确保可以施加较高电场(60～120 V/cm)(报道的制备型电色谱多用20～50 V/cm的低电场),分离过程稳定。
　　 在本论文的主体部分,分别论述了以常用于分离小分子物质的非极性大孔吸附树脂、可以与阴离子物质构成离子排斥色谱的阳离子交换凝胶和具有多孔结构的排阻凝胶为固定相,用设计的制备型电色谱装置分离几种小分子极性物质,包括茶多酚、单核苷酸和水溶性头孢菌素的研究结果。
　　 在装有聚苯乙烯型非极性DIAION HP20树脂的色谱柱上加反向电场(色谱柱入口加负极,出口加正极),可以从含有咖啡因的茶叶粗提物中部分分离茶多酚单体表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)和表儿茶素没食子酸酯(ECG)。研究表明,色谱的主要影响因素--固定相颗粒度、色谱流速和缓冲液中乙醇浓度,电泳的主要影响因素--缓冲液pH值等对样品的保留时间都有明显影响,证明该分离系统实现了电泳与非极性吸附色谱的叠加。在分离过程中,电泳、电渗和色谱都对分离有一定作用。在通电过程中,电场的存在还通过影响样品在DIAION HP20树脂颗粒内的传质,影响样品的非极性吸附色谱行为。由于实验中使用的树脂颗粒内孔径较小(<30 nm),不足以引起颗粒内液体的电渗流动,导致带有样品的液体不易进入树脂颗粒内,传质减慢。尤其是EGCG和ECG,因为样品分子内的非极性基团的分布不对称,色谱保留时间受电场影响更明显。通过增大柱内径,保持柱长不变的方式对电色谱柱进行了放大,结果施加相同的电场,可有效减少放大后的焦耳热。放大后电泳仍然可与色谱作用叠加,但由于色谱柱的高径比减小,损失了部分柱效,降低了分离效果。
　　 在填充弱酸性阳离子交换葡聚糖凝胶的离子排斥色谱柱上加反向电场(色谱柱入口加负极,出口加正极),凝胶上的羧酸基团可以被正极电解产生的氢离子质子化,而且随着通电时间的延长,凝胶的质子化程度提高,结果茶多酚(EGCG和ECG)与咖啡因的分离度增加,直到被完全分离。本课题首次研究了在离子排斥色谱柱上施加电场的分离,结果表明出口电极的电解反应修饰了固定相,减弱了样品与固定相之间的离子排斥力,从而改善了样品的色谱行为,是电场影响分离的主要因为。目前关于制备型电色谱的研究还未见涉及该原理,该法可以为类似的多酚或弱酸物质的分离纯化提供参考。与在吸附色谱柱上通电分离茶多酚的情况相比,此时电场的作用机理截然不同,体现了电场影响样品色谱行为的不同方面。
　　 用分离生物大分子常用的排阻凝胶为固定相,通电分离亲水性小分子--单核苷酸混合物和头孢菌素混合物的研究,与前两种分离茶多酚的方法不同,这里使用的排阻凝胶不与或微弱地与样品发生吸附作用,所有样品在不加电场时的保留时间相同,丝毫不能被分离。排阻凝胶的主要作用是作为电泳填充介质,防止样品返混,并实现在线检测与收集。通电后,样品可以按照带电量差异被分离,因此该系统也可以看作制备型电泳系统。研究发现,凝胶内孔径越大,电泳分离效果越好。用恒组分缓冲液分离单核苷酸混合物时,根据电泳方向与液体流动方向一致还是相反,可以减小或延长样品的保留,并根据带电量分离样品。在此基础上,结合pH梯度缓冲液建立了等电聚焦电泳法,根据两性头孢菌素的等电点分离并浓缩了4种头孢菌素分子,分离时间比离子交换色谱法短,样品峰集中,缓冲液的轻微变化也不影响分离效果。等电聚焦电泳法用低浓度的乙酸和氨水溶液(0.01 mol/L)制作pH梯度,价格便宜,配制方便,不仅可以用于结构相似的小分子物质的细分和精制,还可以用于极性小分子物质的浓缩。
　　 综上所述,本课题主要针对极性小分子物质的分离建立了制备型电色谱装置及4种在色谱柱上施加电场的分离方法,主要使用水溶液分离极性或弱极性小分子物质,并且都用水溶解样品上样。4种施加电场的方法的分离机理各不相同,但都体现了电场提高样品分离度和洗脱浓度的优点。建立的各种方法适合分离可溶于水的极性小分子物质,可以与常用的分离亲脂性化合物的制备型反相高效液相色谱和硅胶柱-有机溶剂法互补,有广阔的应用前景和实际价值。

目录

文摘

英文文摘

上海交通大学学位论文答辩决议书

符号说明

第一章 绪论

1.1 生物分离技术概述

1.1.1 色谱技术

1.1.2 电泳技术

1.2 电色谱概述

1.2.1 分析型电色谱技术

1.2.2 施加电场的高压液相系统

1.2.3 低压制备型电色谱技术

1.3 本课题的主要工作

1.3.1 研究目标

1.3.2 研究内容

第二章 电色谱装置的设计和操作

2.1 简易制备型电色谱装置的构造

2.2 制备型电色谱仪的构造

2.3 制备型电色谱仪的操作过程

2.4 主要实验仪器及设备

第三章 非极性吸附树脂柱上电色谱分离茶多酚和咖啡因

3.1 实验材料

3.2 实验方法

3.2.1 茶叶粗提物中主要成份的分离与鉴定

3.2.2 分离茶叶粗提物的色谱和电色谱操作

3.2.3 HPLC分析条件

3.2.4 电色谱的考察方法

3.3 用恒组分缓冲液进行电色谱分离带电物质的原理

3.4 实验结果与讨论

3.4.1 样品成份的测定结果

3.4.2 固定相颗粒度的确定

3.4.3 流量对色谱分离的影响

3.4.4 流动相对分离的影响

3.4.5 外加电场对分离的影响

3.4.6 加样方式对分离的影响

3.4.7 电色谱的放大研究

3.5.小结

第四章 阴离子排斥色谱柱加电场分离茶多酚和咖啡因

4.1 实验材料

4.2 实验方法

4.2.1 制备质子化凝胶的“悬浮液质子化法”

4.2.2 滴定法测定凝胶的质子化程度

4.2.3 离子排斥色谱和电色谱操作

4.3 实验结果与讨论

4.3.1 对质子化凝胶的制备和滴定方法的评价

4.3.2 凝胶质子化程度对阴离子排斥色谱的影响

4.3.3 电场对阴离子排斥色谱的影响

4.3.4 “悬浮液质子化法”和“电场质子化法"的比较

4.3.5 双色谱柱法制备EGCG和ECG

4.4.小结

第五章 体积排阻凝胶柱上电泳分离核苷酸

5.1 实验材料

5.2 实验方法

5.2.1 制备型电泳的操作

5.2.2 HPLC分析条件

5.3 分离AMP、ADP和ATP的实验结果

5.3.1 固定相对分离的影响

5.3.2 流动相对分离的影响

5.3.3 外加电场对分离的影响

5.4 分离AMP、CMP和UMP的实验结果

5.4.1 固定相对分离的影响

5.4.2 流动相对分离的影响

5.4.3 外加电场对分离的影响

5.4.4 电动保留机制的放大研究

5.4.5 电动保留机制与离子交换色谱和RP-HPLC的比较

5.5.小结

第六章 体积排阻凝胶柱上等电聚焦分离头孢菌素

6.1 实验材料

6.2 实验方法

6.2.1 PH梯度的制作及新型等电聚焦电泳法的操作

6.2.2 HPLC分析条件

6.3 用梯度缓冲液进行等电聚焦电泳分离两性物质的原理

6.4 实验结果与讨论

6.4.1 缓冲液的选择

6.4.2 电场对PH梯度的影响

6.4.3 pH梯度对分离的影响

6.4.4 PH梯度对样品的浓缩效应

6.5 小结

第七章 离子交换柱色谱分离头孢菌素

7.1 实验材料

7.2 实验方法

7.2.1 树脂交换容量的测定

7.2.2 树脂滴定曲线的测定

7.2.3 用PH梯度洗脱法分离头孢菌素混合物的操作

7.2.4 用盐浓度梯度洗脱法分离头孢菌素混合物的操作

7.2.5 HPLC分析条件

7.3 实验结果与讨论

7.3.1 树脂性质的测定结果

7.3.2 用PH梯度洗脱法分离头孢菌素混合物

7.3.3 用盐浓度梯度沈脱法分离头孢菌素混合物

7.3.4 离子交换色谱法与等电聚焦电泳法的比较

7.4.小结

结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文、申请专利和获奖情况