组织工程骨修复牙种植体周围骨缺损的实验研究

摘要

目的：
　　 足够骨量的存在是种植体植入的前提条件,然而相当多的患者由于各种因为导致局部骨量不足。本研究根据组织工程学的方法,利用体外成骨诱导的Beagle犬BMSCs作为种子细胞,复合PRP,在激动剂的作用下,构建BMSCs/PRP复合凝胶,回植入Beagle犬的种植体周围骨缺损中,观察BMSCs/RPP复合凝胶修复牙种植体周围骨缺损的效果,探讨可注射组织工程骨修复牙种植体周围的骨缺损的可行性。
　　 方法：
　　 1.自Beagle犬股骨头抽取骨髓,采用贴壁法培养BMSCs,体外分离、扩增BMSCs,并向成骨细胞诱导,对细胞进行①倒置显微镜观察,②BMSCs的鉴定,③碱性磷酸酶检测,④骨钙素免疫荧光染色,⑤VonKossa染色。
　　 2.抽取Beagle犬静脉血,通过两次离心法制备PRP；将不同浓度的PRP液加入DMEM培养液中行细胞培养,通过MTT比色法和细胞形态观察检测PRP对BMSCs促增殖作用；应用ALP活性及钙结节染色法检测PRP对BMSCs成骨分化的影响。
　　 3.选取普通级成年Beagle犬6条,拔除Beagle犬双侧下颌8个前磨牙,建立实验模型,Beagle犬拔牙3月后在双侧下颌缺牙区分别植入4颗BLB4mm×11mm种植体,且在每个种植体的近中制造4mm×4mm×5mm大小的骨缺损,在每个骨缺损内分别植入BMSCs/PRP复合凝胶、自体骨、BMSCs/β-TCP复合物以及空白对照组。在植入种植体后的第4、8、12周分别处死1组实验。Beagle犬,取材,通过大体标本观察、X线检查、骨密度测量、环境扫描电镜观测和组织学检查等手段,观察各个时期实验组和对照组的骨缺损区成骨情况以及新生骨与种植体间骨结合情况。
　　 结果：
　　 1.Beagle犬BMSCs的体外诱导、分化、增殖和相关检测:①倒置显微镜观察:接种培养3d,换液除去悬浮的血细胞等成分,低倍镜下可见细胞贴壁,积聚成团,呈成纤维细胞样集落生长,10～14d细胞集落间相互融合成单层,形态多为梭形,进行传代,传代后细胞增殖加快；细胞二次传代加入成骨诱导液,6～7d左右单层长满,细胞体积变大,形态变多角形,继续诱导培养,细胞呈现单层融合现象。②BMSCs的鉴定:免疫组化SP法检测,CD44、CD29表达阳性,证明所培养的细胞具有间充质干细胞的特性。③BMSCs成骨诱导2周后ALP染色出现强阳性,胞浆内可见大量黑色颗粒沉积。④骨钙素表达阳性,免疫荧光染色示胞浆出现黄色荧光；⑤BMSCs成骨诱导3周后Von Kossa染色可见钙结节阳性表达。
　　 2.PRP的制备及其对骨髓基质细胞增殖分化的影响:①通过两次离心法制备PRP,PRP中血小板的浓度为全血中的5倍左右。②通过MTT法检测显示不同浓度的PRP对BMSCs增殖均有促进作用,且和PRP浓度密切相关,15％PRP增殖效果最强。③细胞形态的相差显微镜直接观察和免疫荧光观察细胞骨架蛋白actin表达,提示PRP对BMSCs增殖有促进作用。④ALP活性检测及Von kossa染色提示PRP促进BMSCs成骨分化。
　　 3.BMSCs/PRP复合凝胶修复牙种植体周围骨缺损:所有实验组在术后4、8、12周均有不同程度的骨组织再生,而对照组只有少量骨组织再生。植入BMSCs/β-TCP的缺损区,β-TCP逐渐吸收,但术后12周仍有残留,成骨性能良好；而植入BMSCs/PRP的缺损区,各个时期材料均完全吸收,缺损区内新骨骨密度均较其他3组高,且新生骨与种植体的骨结合明显高于其他3组。
　　 结论：
　　 1.Beagle犬BMSCs通过成骨诱导液在体外可以向成骨细胞分化,Beagle犬BMSCs在体外具有良好的向成骨细胞诱导、分化和增殖能力,可以满足本实验中种子细胞的需要。
　　 2.PRP能够促进BMSCs增殖和向成骨细胞分化,其富含的生长因子满足组织工程生长因子要素的要求。
　　 3.BMSCs/PRP复合凝胶可以促进种植体周围骨缺损区新骨形成,促进种植体骨结合。
　　 4.自体BMSCs/PRP复合凝胶,构建可注射组织工程骨,用来修复种植体周围骨缺损,克服了异体移植带来的免疫原性和疾病传播的缺点,组织再生能力强,为临床应用提供了实验依据,利用可注射组织工程骨可很好的修复种植体周围的骨缺损。

目录

文摘

英文文摘

中英文缩略词表

前言

第一部分 骨髓基质细胞的分离培养与检测

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分 富血小板血浆的制备及其对骨髓基质细胞增殖分化的影响

材料与方法

结果

讨论

小结

第三部分 骨髓基质细胞复合富血小板血浆修复种植体周围骨缺损的实验研究

材料与方法

结果

讨论

小结

全文结论

参考文献

致谢

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综述

参考文献