外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌收缩的调控作用及其机制

摘要

硫化氢(H2S)在哺乳动物的不同组织中产生,并在机体的生理以及病理过程中起了重要的调节作用。然而,关于硫化氢对胃肠道平滑肌动力的影响及其机制的研究报道甚少。因此,本文利用生理学以及电生理学方法探讨了外源性硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌自发性运动的影响及其离子通道机制。本文包括以下三部分实验:(1)观察了硫化氢对豚鼠胃窦平滑肌肌条自发性收缩影响以及毒蕈碱M受体激动剂卡巴胆碱诱导的肌条收缩的影响；(2)通过全细胞模式膜片钳技术,记录和观察了新鲜分离的单个胃窦平滑肌细胞的膜电流,研究了硫化氢作用的离子通道机制；(3)为进一步研究硫化氢对胃肠起搏细胞Cajal间质细胞起搏功能的影响,在新鲜分离的小鼠胃Cajal间质细胞进行组织学鉴定和电生理特性的初步研究,为今后研究H2S对胃起搏功能的调控作用打下基础。
　　 结果：显示:①NaHS在高浓度时(0.3-1.0mM)抑制自发性收缩的幅度,而在较低浓度时(0.1-0.3mM),降低自发性收缩幅度的同时明显增加收缩的张力；②当用非选择性钾通道阻断剂TEA(10mM)或者电压依赖性钾通道阻断剂0.5mM的4-氨基吡啶(4-AP)预处理时,低浓度硫化氢引起的收缩张力增加效应完全被阻断。然而,单独使用低浓度TEA(1mM)时,不能完全阻断低浓度NaHS引起的张力增加效应,但与4-AP联合使用后则完全阻断其张力增加效应；③NaHS和KATP通道开放剂吡那西地(Pinacidil)均可明显抑制胃平滑肌自发收缩,而KATP通道阻断剂格列本脲(Glibenclamide)部分逆转NaHS和吡那西地的抑制效应；④低浓度NaHS对毒蕈碱M受体激动剂50μM卡巴胆碱(Carbachol,Cch)诱导的胃平滑肌自发性收缩具有双向作用,即明显抑制Cch诱发的收缩幅度并同时明显增加其张力；⑤毒蕈碱M受体阻断剂阿托品(Atropine,15μM)在未经Cch预处理的肌条上,削弱了低浓度NaHS引起的肌张力增加,也可完全消除Cch存在情况下低浓度NaHS引起的肌张力增加效应,并显著抑制收缩幅度；⑥NaHS可呈剂量依赖性的增加ATP敏感性钾通道(KATP通道)电流,但是抑制电压依赖性钾通道(KV通道)电流。低浓度NaHS对自发性瞬时外向电流(STOCs)无作用,而高浓度NaHS却显著抑制STOCs；⑦NaHS可呈剂量依赖性的增强Cch诱导的毒蕈碱电流；⑧新鲜分离小鼠胃平滑肌细胞中有c-Kit蛋白表达呈阳性的细胞,其形态呈短梭形并带有突起。在全细胞模式下,在c-Kit蛋白表达阳性的细胞上可以记录到自发并具有节律性的内向电流。钙调蛋白抑制剂W-7以及增加电极内液中EGTA的浓度都明显增强其电流幅度并引发明显的内向钳制电流。
　　 实验结果提示,(1)H2S对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩具有双重作用,即抑制作用和兴奋作用。兴奋性作用通过抑制KV通道所介导,而抑制性作用是通过激活KATP通道所介导；(2)H2S对毒蕈碱受体激动剂Cch引起的收缩也具有双重调控作用,即低浓度H2S对Cch诱导的收缩起兴奋作用,而这种兴奋性作用是通过增加毒蕈碱电流所介导,而对Cch诱导的收缩所起的抑制作用则是通过激活KATP通道来实现的；(3)新鲜分离的小鼠胃ICC样细胞可以产生自发、自律性内向电流,而这种电流对胞内低钙或钙调蛋白抑制剂敏感。这种具有自发性电活动的ICC样细胞可能就是胃Caial间质细胞。

目录

文摘

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英文缩略语

第一章 外源性H2S对豚鼠胃窦平滑肌自发性收缩的影响及其离子通道机制

1.1 引言

1.2 实验材料及仪器

1.2.1 实验仪器

1.2.2 试剂

1.2.3 主要溶液及配制

1.3 实验方法

1.3.1 组织准备与肌条实验

1.3.2 细胞制备与电生理记录

1.3.3 膜片钳实验技术

1.3.4 统计学方法

1.4 实验结果

1.4.1 不同浓度NaHS对胃窦平滑肌条自发性收缩的影响

1.4.2 TEA与4-AP预处理对NaHS作用的影响

1.4.3 NaHS对ATP敏感性钾通道电流的作用

1.4.4 NaHS对电压门控钾通道电流的作用

1.4.5 NaHS对钙激活钾通道电流的作用

1.5 讨论

1.6 本章小结

1.7 参考文献

第二章 H2S对毒蕈碱受体激动剂诱发的胃平滑肌收缩的影响及其机制

2.1 引言

2.2 实验材料及仪器

2.2.1 实验仪器

2.2.2 试剂

2.2.3 主要溶液及配制

2.3 实验方法

2.3.1 组织准备与肌条实验

2.3.2 细胞制备与电生理记录

2.3.3 膜片钳放大器数据设置

2.3.4 统计学方法

2.4 实验结果

2.4.1 卡巴胆碱诱发的胃平滑肌条收缩

2.4.2 NaHS对Cch诱导平滑肌收缩的影响

2.4.3 NaHS对Cch诱导平滑肌运动的抑制性作用的离子机制

2.4.4 阿托品对NaHS增加Cch诱导的平滑肌收缩张力的影响

2.5 讨论

2.6 本章小结

2.7 参考文献

第三章 新鲜分离小鼠胃CAJAL间质细胞样细胞的鉴定及其电生理学特性

3.1 引言

3.2 实验材料及仪器

3.2.1 实验仪器

3.2.2 试剂

3.2.3 主要溶液及配制

3.3 实验方法

3.3.1 新鲜分离ICC的方法

3.3.2 免疫学鉴定

3.3.3 电生理实验方法

3.3.4 统计学方法

3.4 实验结果

3.4.1 胃ICC样细胞形态特征

3.4.2 胃ICC样细胞免疫荧光细胞化学鉴定

3.4.3 ICC样细胞电活动的观察

3.4.4 W-7对胃ICC样细胞自发性内向电流的影响

3.4.5 胞内低钙对胃ICC样细胞自发性内向电流的影响

3.5 讨论

3.6 本章小结

3.7 参考文献

全文小结

第四章 综述硫化氢的最新研究进展

4.1 H2S的理化特性

4.2 H2S在不同组织中的合成代谢及生物学效应

4.2.1 H2S在神经系统中的合成与生物学效应

4.2.2 H2S在心血管系统中的合成与生物学效应

4.2.3 H2S在胰腺中的合成与生物学效应

4.2.4 H2S在胃肠道系统中的合成与生物学效应

4.3 H2S与疾病的关系

4.4 H2S与其他两种气体信号分子的关系

4.4.1 H2S与NO的关系

4.4.2 H2S与CO的关系

4.5 问题与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间已发表的论文

研究报文