猪链球菌噬菌体SMP裂解酶在乳酸乳球菌中的表达及活性研究

摘要

猪链球菌病是一种重要的人兽共患传染病，能导致仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎以及人的脑膜炎，对公共卫生尤其是相关从业人员的生命安全构成严重威胁。对猪链球菌病一般采用抗生素治疗，然而近年来由于抗生素的滥用等原因，产生了许多耐药菌株，给该病的防控带来了困难。研究发现噬菌体编码的裂解酶具有作用迅速且不易使细菌产生抗性的特点，逐渐成为一种有潜力的杀菌制剂。本研究通过乳酸乳球菌表达系统重组表达了猪链球菌噬菌体裂解酶(LySMP)，并研究了该酶的生物学特性。
　　本研究通过重组表达的方法获得具有生物学活性的猪链球菌噬菌体LySMP。采用PCR扩增噬菌体SMP的LySMP基因，插入到质粒pNZ8148中，构建出重组表达载体pNZ8148-LySMP。将该载体转化到乳酸乳球菌Lactococcus lactisNZ9000细胞中。用Nisin在30℃诱导表达3 h，表达产物经SDS-PAGE电泳分析，确定所得表达产物为53kD的LySMP蛋白。在酶谱试验中，LySMP在53kD处可形成透明条带，表明该蛋白具有裂解宿主菌SS2-H的活性。
　　Western-blotting试验表明，大肠杆菌pET-28a-LySMP-BL21(55 kD)和乳酸乳球菌pNZ8148-LySMP-NZ9000(53 kD)所表达的LySMP蛋白均可被LySMP多抗血清识别，确定二者所表达的LySMP是一致的，但是表达的LySMP水平有所差别。
　　通过对LySMP体外生物学活性的研究，确定了LySMP最适工作条件，以及LySMP的裂解谱。在平板裂解试验中，利用乳酸乳球菌表达系统及pNZ8148表达载体所表达LySMP的超声破碎粗提物，具有比原始噬菌体更广的裂解谱。在17株猪链球菌2型菌株中，有7株可被裂解，另外，7型菌株SH040805，9型菌株SH040817也可被裂解，形成透明的抑菌圈。其中，LySMP对3株猪链球菌2型菌株和1株猪链球菌9型菌株的裂解活性最强。对金黄色葡萄球、马链球菌兽疫亚种、大肠杆菌以及沙门氏菌的裂解活性较弱。此外，宿主菌NZ9000对LySMP亦不敏感。
　　通过比较LySMP在不同条件下对细菌裂解导致浊度递减的百分数，确定了LySMP的最适工作条件。结果表明，LySMP在37℃，pH7.2的条件下，裂解效率最高。浊度递减试验显示，LySMP在37℃，pH7.2的条件下，对猪链球菌9型菌株SH040817和7株猪链球菌2型菌株、大肠杆菌E.coli MC1061以及沙门氏菌NATSEL0114有较高的裂解活性，浊度下降可达30％-77%。其中，对猪链球菌2型菌株S.suis1-19的裂解活性最高。但是，LySMP对金黄色葡萄球菌和马链球菌兽疫亚种裂解效果不佳。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

第一篇文献综述

第一章 猪链球菌和噬菌体裂解酶的研究进展

1.1猪链球菌的研究概况

1.2噬菌体裂解酶的研究概况

1.3 乳酸乳球菌表达系统的研究现状

1.4本文的研究目的及意义

第二篇 实验研究

第二章 噬菌体LySMP的表达

2.1材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 噬菌体LySMP的生物学特性

3.1 材料与方法

3.2 结果

第四章 全文结论

参 考 文 献

溶液配制 附录1

符号说明 附录2

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文