富集骨髓基质干细胞复合生物材料修复犬眼眶骨缺损

摘要

眼眶遭受外伤、肿瘤及炎症等侵害时易造成骨性结构的破坏，引起眶壁骨质缺损，导致面中部畸形、眼球位置及视功能异常。目前临床应用的各种修复材料均存在一定缺陷，而组织工程技术为眼眶骨修复治疗带来了希望。但目前组织工程骨构建中的细胞来源多靠体外培养获得，存在耗时、安全性及经济耗费等问题。如何快速、安全并且有效地把骨髓血中具有成骨能力的干细胞分离浓缩，并有效的与生物支架材料复合是组织工程技术能够大规模应用于临床的前提条件。
　　 目的：
　　 应用红细胞裂解技术将骨髓血中具有成骨能力的干细胞快速分离浓缩，经自制体外干细胞-材料融合装置与β-磷酸三钙(β-TCP)支架材料复合，构建组织工程骨，探讨修复眼眶骨缺损的可行性。
　　 方法：
　　 1.将骨髓血经红细胞裂解液处理后，获得的有核细胞行体外成骨诱导培养，对其中的骨髓基质干细胞(BMSCs)进行细胞形态学及成骨活性检测，分析红细胞裂解液对干细胞生理特性的影响。
　　 2.将骨髓血中通过红细胞裂解处理获得的有核细胞，经体外自制干细胞-材料融合装置，与β-TCP支架材料进行体外复合，通过扫描电镜观察细胞在支架内分布及贴附情况。将该细胞-材料复合体植入犬背部皮下，植入后1个月取材进行组织学检测，分析其异位成骨能力。
　　 3.经红细胞裂解处理获得的干细胞与β-TCP材料体外复合构建组织工程骨，对犬眼眶壁骨缺损进行修复实验。对未经处理的骨髓血及红细胞裂解液处理后的细胞悬液行有核细胞计数及碱性磷酸酶(ALP)染色阳性细胞集落的计数。在术后1周、4周、12周和24周分别进行螺旋CT检查和三维重建观察。术后24周取材，进行大体观察、Micro-CT检查及组织学观察，对结果进行统计分析，评价修复效果。
　　 结果：
　　 1.犬骨髓血经红细胞裂解液处理后，干细胞经体外成骨诱导培养后，ALP、钙结节染色呈强阳性，表达成骨标志性蛋白(OCN，OPN，BSP，Cbfal、I型胶原等)，与未经红细胞裂解液处理的干细胞在成骨能力及成骨活性等方面无明显差异。
　　 2.干细胞经自制体外干细胞-材料融合装置与β-TCP复合2小时后，扫描电镜观察材料内部有干细胞均匀分布，且细胞贴附良好。同时，构建的组织工程骨具有良好的异位成骨能力。
　　 3.通过计算浓缩前后干细胞及有核细胞计数，材料内有核细胞浓度及干细胞浓度分别提高53倍及49倍;实验组CT影像随访可见材料逐渐吸收并伴有新骨的形成，同时伴有骨改建的发生;Micro-CT和组织学检查显示实验组新生骨与周围眶壁已形成骨性连接，实验组有6侧(75％)眼眶骨性缺损基本被完全修复，而对照组仅有一例只在缺损最大直径形成骨性连接，统计结果有显著性差别(P＜0.05)。
　　 结论：
　　 1.骨髓血经红细胞裂解液处理后获得的BMSCs生物活性未受影响，能够稳定向成骨细胞分化并保持良好成骨活性及增殖能力。
　　 2.自设计体外材料-干细胞复合装置能够快速、高效的将BMSCs与支架材料复合。
　　 3.经自设计体外材料-干细胞复合装置构建的β-TCP与BMSCs组织工程骨，具备良好的生物学活性，能够异位成骨。
　　 4.利用红细胞裂解处理体外构建的组织工程骨，将有核细胞和干细胞分别浓缩53倍和49倍，数量上能够满足眼眶骨组织工程的需要。
　　 5.利用红细胞裂解处理构建的组织工程骨能够有效修复眼眶骨缺损，新生骨同时发生适应眶壁结构的生理功能改建。

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摘要

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第一章 前言

1．1 研究意义和背景

1．2 本论文的研究目的及主要内容

第二章 骨髓基干细胞的体外快速富集、诱导培养及检测

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

第三章 骨髓基质干细胞与Β-TCP支架材料融合及其异位成骨能力的研究

3．1 引言

3．2 材料和方法

3．3 结果

3．4 讨论

3．5 结论

第四章 构建组织工程骨修复犬眶内侧壁骨缺损

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．3 结果

4．4 讨论

4．5 结论

第五章 全文总结与展望

参考文献

附录

致谢

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