七氟醚影响大鼠学习记忆的双向作用及其机制研究

摘要

研究背景：
　　 术中知晓和术后认知功能障碍是困扰麻醉医师的棘手问题，以往多认为与全身麻醉药物对神经系统的损伤有关。但近来不断有实验研究证实，低浓度吸入麻醉气体在特定环境下反而会兴奋大脑功能，甚至产生脑保护的作用。显然全身麻醉药物对大脑认知功能的影响机制仍未完全明了。全身麻醉药物七氟醚已广泛应用于各类临床手术，其对哺乳类动物中枢神经系统是否及如何产生影响是我们一直在探讨的课题。细胞骨架蛋白ARC可在大脑海马组织中大量表达，其表达情况可用于推测神经元的活性，以及突触可塑性的变化。目前认为其表达程度可作为检测学习记忆形成的指标。近来有学者发现，较低浓度的七氟醚可引发中枢神经兴奋现象，并猜测亚麻醉剂量对于中枢神经系统具潜在保护作用。细胞外信号调节激酶(ERK1/2)及其信号通路是神经元中传递兴奋性刺激入胞，并通过调节下游级联反应来干预神经元内多种活性基因产物(参与突触重塑)表达的重要信号通路之一，已被证实参与神经发育、存活及重塑等活动。ERK1/2是丝裂原激活的蛋白激酶(MAPK)超家族中的一员，在中枢神经系统中ERK1/2信号通路在多种行为学习实验如空间学习(spatial learning)中参与了记忆的形成，并在大脑的海马部位(记忆中枢)更为活跃。但目前对ERK1/2通路是否通过调节ARC表达参与七氟醚对于记忆的调节仍未获得肯定的答案。
　　 为验证这一现象并探索其可能的机制，本研究以大鼠七氟醚吸入麻醉模型为研究对象，以大鼠海马ARC蛋白和SYNAPSIN-1蛋白的表达为研究指标，通过检验在抑制性逃避(inhibitory avoidance，IA)行为实验中不同浓度七氟醚吸入对记忆的调节，并假设ERK1/2途径可能为影响细胞内ARC转录与表达的上游通路，再通过大鼠脑内海马注射相应剂量的ERK1/2抑制剂U0126，来观察ERK1/2途径的抑制是否能逆转麻醉药对于ARC表达的干扰，藉此探讨神经元细胞内ERK1/2信号通路对ARC及突触相关蛋白SYNAPSIN-1表达的干预及在此记忆调节中的作用，并将不同麻醉条件下相关学习记忆所受改变与神经元突触可塑性活动及胞内外信号通路相结合，从而进一步完善全麻药物的脑内作用机制。
　　 方法：
　　 研究一和研究二：250～300g雄性SD大鼠随机分为3组：空白组(Sham组)、极低浓度七氟醚吸入组(0.11％SEV)和低浓度七氟醚吸入组(0.3％SEV)。依据分组依次将大鼠安置于连接有低流量(0.5L/min)闭合环路吸入麻醉系统的特制容器内，分别给予吸入空气、0.11％SEV(0.05MAC)和0.3％SEV(0.14MAC)各45min。结束后立即进行单次IA训练(0.4mA，3s)，24小时后进行IA记忆(潜伏期)检测。另取一批大鼠在IA初次训练后45min处死取材，以Western-blotting方法检测脑内海马ARC蛋白的表达水平，以real-time PCR方法检测ARC的mRNA转录水平。
　　 研究三：250～300g雄性SD大鼠随机分为4组：空白组(Sham组)、极低浓度七氟醚吸入组(0.11％SEV)、低浓度七氟醚吸入组(0.3％SEV)和低浓度七氟醚吸入组+U0126组(0.3％SEV+U0126组)。首先，依据分组大鼠双侧海马注射生理盐水稀释后U0126(总计0.5μl，10nM)或等体积的生理盐水。15分钟后依次将大鼠安置于连接有低流量(0.5L/min)闭合环路吸入麻醉系统的特制容器内，分别给予吸入空气、0.11％SEV(0.05MAC)和0.3％SEV(0.14MAC)各45min。结束后马上进行单次IA训练(0.4mA，3s)，24小时后进行IA记忆(潜伏期)检测。另取一批大鼠在IA初次训练后45min处死取材，以Western-blotting方法检测脑内海马ERK1/2磷酸化水平、ARC和SYNAPSIN-1蛋白的表达水平。
　　 结果：
　　 1)与Sham组相比较，0.11％SEV吸入组大鼠表现为记忆增强，0.3％SEV吸入组大鼠表现为遗忘效应，各潜伏期间均有统计学差异(与sham组相比，P<0.05)。
　　 2)与Sham组相比较，0.3％SEV显著降低ARC蛋白的表达，而0.11％SEV却增强ARC蛋白的表达(P值均小于0.05)。对Sham组、0.11％SEV组以及0.3％SEV组大鼠海马组织用Realtime PCR检测ARC mRNA表达，结果显示：三组大鼠海马组织ARC mRNA表达均无差异。(P<0.05)。
　　 3)埋管后进行IA实验，与Sham组大鼠比较，0.11％SEV组大鼠仍表现为记忆增强，0.3％SEV组大鼠表现为遗忘效应(与Sham组相比，均P<0.05)。0.3％SEV+U0126处理组大鼠的潜伏期显著延长，与0.3％SEV组和Sham组相比有统计学差异(P<0.05)，与0.11％SEV组相比没有统计学差异。
　　 4)与Sham组相比较，0.11％SEV组的ERK1/2磷酸化水平较低，而0.3％SEV组和0.3％SEV+U0126组的ERK1/2磷酸化水平较高(差异均有统计学意义，P<0.05)。且0.3％SEV组与0.3％SEV+U0126组比较无统计学差异(P>0.05)。与Sham组的ARC和SYNAPSIN-1表达水平相比较，0.11％SEV组显著升高，而0.3％SEV组明显降低(P<0.05)，而0.3％SEV+U0126组的表达水平再次升高(与Sham组和0.3％SEV组相比，P<0.05)。
　　 结论：
　　 1、七氟醚可以双向调节大鼠的记忆形成。
　　 2、ARC这种活性调节基因的蛋白产物可能存在翻译后水平的表达调控机制，即某些神经元内信号转导机制参与了七氟醚双向调节学习记忆的现象产生。
　　 3、七氟醚通过ERK1/2信号转导通路对海马ARC蛋白表达和突触相关蛋白SYNAPSIN-1进行调控，并因此双向改变大鼠IA后学习记忆的形成。
　　 4、吸入麻醉药七氟醚在低于全麻浓度时具有双向调节哺乳动物学习记忆的作用，该作用需要脑内海马部位的神经元活化和突触可塑性变化，ERK1/2信号转导通路参与了这些神经生物学改变，海马作为记忆的中枢也是七氟醚发挥作用的关键部位之一。