加压毛细管电色谱二维联用技术的研究及其在复杂体系分离中的应用

摘要

加压毛细管电色谱（pCEC）以压力流结合电渗流为驱动力，克服了电色谱本身不能定量进样、焦耳热明显和易产生气泡等缺点，同时可提供梯度洗脱，有利于复杂样品的分离分析。近年来，由于各种组学的出现，对分析技术提出了更大的挑战。两维联用技术结合两种不同分离机理的分析模式，可以有效地提高系统的峰容量和分辨率，为复杂样品的分析提供了更好的分离手段。加压毛细管电色谱对带电物质本身就兼具毛细管电泳和高效液相色谱的双重机理，进一步发展加压毛细管电色谱技术的二维联用，将提供一种基于三重分离机理基础上的分析平台，具有更好的选择性和更大峰容量，应用领域十分广阔。本论文将建立基于加压毛细管电色谱的二维联用技术，并用于中药、生物样品等复杂样品的分离分析，取得了较好的结果。
　　本论文共分为六章，主要包括：
　　第一章介绍了选题背景和意义。主要介绍了毛细管电色谱和加压毛细管电色谱的基本原理和色谱柱技术，并描述了二维色谱联用技术的特点和研究进展，在此基础上阐述了发展加压毛细管电色谱二维联用技术的优势。
　　第二章将加压毛细管电色谱用于中药黄柏提取液的分离分析。通过对提取溶剂、流动相组成、检测波长、施加电压等条件的优化，建立了中药黄柏提取液的加压毛细管电色谱分析方法。其中着重讨论了电压对黄柏分离的影响，并以药根碱、小檗碱和巴马汀等三种标准品为验证对象，研究了pCEC的双重选择性。发现与通常的微径液相相比，pCEC可调节参数多，对优化复杂样品的分离具有更多和更好的可能性，为其在二维联用中发挥电压对分离带来的独特优势提供了方法基础。
　　第三章构建了强阳离子交换-反相双相整体柱加压毛细管电色谱（Biphasic SCX-RP monolithicpCEC2D system）二维系统。为了实现二维联用体系的简单、方便和实用，在本实验中将SCX和RP两种填料通过整体柱技术合成在一根毛细管中，制成新型SCX-RP双相整体柱，并将其应用于二维pCEC的体系，构建了双相柱二维pCEC分离模式。尝试利用NH4Cl盐从SCX柱上进行四步洗脱，再用乙腈-水梯度对RP柱进行洗脱，用于牛血清白蛋白（BSA）酶解液的分离。此技术的实现为二维技术的发展提供了新的思路。
　　第四章建立了强阳离子交换毛细管液相色谱和反相加压毛细管电色谱(μ-SCXLC/RP-pCEC)二维联用系统。通过对单维分析条件、二维体系流动相的匹配度、片段切割次数等条件进行了优化，分别构建了离线和在线两种μ-SCXLC/RP-pCEC二维联用体系，并用于中药、生物样品等几种复杂体系的分析。其中第一维SCX采用NH4Cl盐-水体系，离线模式采用线性梯度洗脱，在线模式采用台阶梯度洗脱；第二维pCEC采用乙腈-水体系，离线和在线模式均采用梯度洗脱。并通过理论深入研究了实验构建的二维系统的正交性、峰容量等表征参数，发现从理论上可证明此二维体系正交程度较高，黄柏、BSA酶解液和人血清酶解液三种样品分离的正交性均超过了75％，三种样品离线体系的实际峰容量达到568、940和576，在线模式达到355、436和480，远远高于单维分离体系，证明构建的二维体系可以有效地提高峰容量和分辨率。
　　第五章构建了两种亲水性液相色谱和反相加压毛细管电色谱二维系统：氰基液相色谱-反相加压毛细管电色谱（CN-LC/RP-pCEC）和氨基液相色谱-反相加压毛细管电色谱（Amide-LC/RP-pCEC）。第一维亲水色谱分别选用氰基和氨基两种亲水模式色谱柱，流动相采用甲醇-水体系；第二维采用反相C18色谱柱，流动相采用乙腈-水体系。利用三种色谱柱对不同极性物质分离能力带来的互补性和正交性，不同流动相带来的选择性，通过离线收集浓缩的方法解决两维流动相匹配问题的基础上，构建了两种离线CN-LC/RP-pCEC和Amide-LC/RP-pCEC二维联用模式，并用于复杂样品BSA酶解液和人血清酶解液的分离分析，峰容量达到了600-700。
　　第六章构建了反相加压毛细管电色谱和反相液相色谱-离子阱质谱（RP-pCEC/RP-LC-LTQ）二维分离系统。考虑到多肽类物质在不同pH值下在反相色谱上保留情况不同，第一维RP-pCEC采用碱性流动相，第二维RP-LC采用酸性流动相，且第二维直接与LTQ质谱相联，用于肝硬化病人蛋白质组学研究。发现此二维体系可鉴定出人血浆酶解液中4760个非冗余肽段。正常人和肝硬化病人的血浆中均鉴定出100个以上的蛋白，并找到了31个差异蛋白。

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符号说明

1. 第一章 绪论

1.1毛细管电色谱研究进展

1.2二维色谱技术的研究进展

1.3本论文的研究意义和研究内容

参考文献

2. 第二章 加压毛细管电色谱分析中药黄柏的方法学研究

2.1前言

2.2实验部分

2.3结果与讨论

2.4小结

参考文献

3. 第三章 二维离子交换/反相双相整体柱加压毛细管电色谱的构

3.1前言

3.2实验部分

3.3结果与讨论

3.4小结

参考文献

4. 第四章 强阳离子交换毛细管液相色谱-反相加压毛细管电色谱

4.1前言

4.2实验部分

4.3结果与讨论

4.4小结

参考文献

5. 第五章 亲水作用色谱-反相加压毛细管电色谱二维系统的构建

5.1前言

5.2实验部分

5.3结果与讨论

5.4小结

参考文献

6. 第六章 反相加压毛细管电色谱-反相液相色谱-质谱多维系统

6.1前言

6.2实验部分

6.3结果与讨论

6.4小结

参考文献

7. 总结与展望

附录

致谢

攻读学位期间已发表和待发表的学术论文目录

上海交通大学博士 学位答辩决议书

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