软骨脱细胞膜片和Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜在软骨组织工程中的应用

摘要

软骨是一种无血管的组织,因其自我修复能力低下,所以软骨损伤或畸形一直以来都是临床治疗的一大难题。组织工程技术为软骨缺损修复提供了一种全新的治疗手段。软骨脱细胞膜片(Acellular cartilage sheet,ACS)是一种天然的生物支架材料,在以软骨细胞为种子细胞,利用三明治模型构建软骨的过程中已经证明软骨脱细胞膜片是一种理想的软骨组织工程支架。如果以骨髓基质干细胞为种子细胞,软骨脱细胞膜片能否表现出一定的软骨诱导潜能以及软骨脱细胞膜片将来的应用前景有待进一步论证。另外,仿生细胞外基质支架材料Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜在软骨组织工程领域的应用前景也是一个值得关注的问题。基于以上目的,本研究分三部分展开一系列的实验研究。
　　第一章:软骨脱细胞膜片诱导骨髓基质干细胞构建软骨
　　方法:将软骨切成10μm厚度的圆形膜片后用SDS进行脱细胞处理,洗涤、冻干后得到软骨脱细胞膜片。利用三明治模型体外复合BMSCs和ACS构建软骨。以PGA为对照,共分4个组:BMSC-ACS诱导组、BMSC-ACS未诱导组、BMSC-PGA诱导组、BMSC-PGA未诱导组。取体外培养4周、体外培养4周加体内培养4周两个时间点进行检测分析。ELISA法检测ACS中的TGF-β1、IGF-1、BMP-2等细胞因子。
　　结果:体外培养4周后各组都形成软骨样组织,但是只有在BMSC-ACS诱导组和BMSC-PGA诱导组才形成软骨陷窝样结构。RT-PCR结构显示:除了BMSC-PGA未诱导组,其余三组都有Ⅱ型胶原和Sox9的表达。植入裸鼠皮下4周后,组织学染色证明BMSC-ACS诱导组和BMSC-ACS未诱导组形成软骨组织。另外,ELISA检测发现ACS中含TGF-β1、IGF-1、BMP-2等细胞因子,且含量和未脱细胞软骨膜片相当。这些结果提示ACS具有一定的软骨诱导潜能。
　　第二章:软骨脱细胞膜片复合骨髓基质干细胞修复猪关节骨软骨缺损
　　方法:同样的方法制备ACS。利用三明治模型体外复合BMSCs和ACS构建软骨。共分4个组:BMSC-ACS组、BMSC-PGA组、单纯ACS组、空白对照组。细胞-材料复合物体外培养3-5天植入体内进行骨软骨缺损修复,缺损直径7mm。取修复术后3个月和6个月两个时间点进行修复效果的评价分析:包括大体观、组织学、生物力学。
　　结果:术后3个月各组修复效果不理想,只有:BMSC-ACS组缺损表面形成很薄的一层软骨样组织;术后6个月时BMSC-ACS组修复效果佳,缺损区新生软骨和软骨下骨组织形成良好,GAG含量、总胶原含量以及生物力学强度分别达到相应区域正常软骨组织的88.83％、85.69％和85.61％;单纯ACS组则分别达到53.42％、51.77％和30.48％;BMSC-PGA组和空白组未见新生软骨和软骨下骨组织。
　　第三章:利用Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜复合软骨细胞构建软骨方法:将Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜处理成直径7mm的圆形膜片状及面积相等的三角形、长方形膜片,利用三明治模型体外复合Chondrocytes和Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜构建软骨。分体外4周、体外16周、体外4周+体内12周、体外4周+体内24周四个组进行评价。将Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜处理成形状和人耳廓支架相当的膜片再复合Chondrocytes在人耳支架上构建人耳廓软骨,4周后植入裸鼠皮下进一步观察,体内6周后取材检测。
　　结果:从大体观、组织学以及生物力学结果看,体内形成的软骨更加成熟,随着培养时间延长,体外或体内形成的软骨各项指标都更接近正常软骨,人耳廓软骨形成良好,Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜是一种理想的软骨组织工程人工合成材料。
　　本研究用科学的方法证实了ACS这种天然的生物支架材料具有软骨诱导潜能,并通过修复大动物关节骨软骨缺损模型为ACS将来应用于临床软骨修复提供一定的理论依据。通过小块软骨构建以及人耳廓软骨构建实验,证实仿生细胞外基质材料Gelatin/PCL纳米纤维电纺膜在软骨组织工程领域具有很好的应用前景。为软骨组织工程支架材料的选择提供更多的选择依据。