钙离子结合蛋白S100A4的原核表达纯化以及S100A6单克隆抗体的制备

摘要

肝脏是人体最大的消化器官,主要负责维持新陈代谢的正常进行。由于肝脏参与食物消化这一特殊功能,使其极易发生病变,引起包括急性肝衰和肝脏纤维化等发病率和死亡率都较高的疾病的发生,从而引起人们的重视。通过CCl4诱导的小鼠急慢性肝损伤模型和基因芯片等技术手段,我们深入探讨了肝脏损伤修复的原理和机制,从而获得治疗肝损伤的全新思路和药物靶点。其中S100家族随着肝脏损伤修复过程呈现的规律性的表达变化,使其成为我们的重点研究对象。
　　本文以S100家族为切入点,主要包括两部分的研究内容:重组人S100A4的原核表达纯化及活性测定和S100A6单克隆抗体的制备。S100A4是S100蛋白家族的成员,在细胞的增殖,分化,损伤修复以及肿瘤细胞转移等方面发挥重要的调控作用。本研究将S100A4全长基因构建到pET28a原核表达载体上,利用大肠杆菌表达系统表达和纯化出高纯度的重组人S100A4。通过试验证明,重组人S100A4蛋白在体外可以有效的增强黑色素瘤细胞A375-S2的增殖。重组人S100A4原核表达与纯化方法的建立将促进其结构和生物学功能研究,并且对于S100蛋白家族其他蛋白的表达与纯化具有重要的参考意义。并且可用于后期对肝脏纤维化模型的药效和药理研究。为了制备抗人S100A6的单克隆抗体,利用原核表达纯化后所得纯度>97％的hS100A6为抗原,与弗氏佐剂相结合免疫Balb/c小鼠。利用杂交瘤技术,处死免疫小鼠,取脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤。采用Elisa检测,并用有限稀释法筛选出分泌特异抗人S100A6抗体的杂交瘤细胞株。腹腔注射同种小鼠诱导腹水产生,并应用Protein G亲和层析法进行抗体纯化。采用单克隆抗体可变区 VH和VL基因组测序,为抗体可变区分区;通过Elisa、Western Blot鉴定该单克隆抗体。结果获得2株可稳定分泌小鼠抗人 S100A6的单克隆抗体,分别命名为5-1G,8-6G。Elisa和Western Blot分析表明该2株单抗均能特异性识别 hS100A6。最终成功制备了2株鼠抗人 S100A6蛋白的单克隆抗体,为建立 S100A6蛋白检测奠定了基础。并且可用于后续S100A6中和抗体调节肝脏纤维化的药理学研究。

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缩略词中英文对照

第一章 绪论

1 肝脏病变的研究现状

2钙离子结合蛋白S100家族研究进展

3基因芯片在肝脏损伤模型上的应用

4 立题依据和研究内容

第二章 重组人S100A4蛋白的表达与纯化

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

第三章 S100A6单克隆抗体的制备

1 引言

2 材料与方法

3 实验结果

4 讨论

第四章 结论和展望

1. 结论

2. 展望

参考文献

附录

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文