环境中5-甲基水杨酸和对甲酚的免疫分析方法研究

摘要

两种结构相似的物质,5-甲基水杨酸和对甲酚均属于目前广受关注的新型微污染物-药品与个人护理品(PPCPs)。本文将5-甲基水杨酸与两种载体蛋白进行偶联,合成人工抗原。然后筛选出合适的免疫原免疫新西兰大白兔,制备出了高效价的抗5-甲基水杨酸抗体。以高效价的抗体为基础,进行多组条件优化,建立了检测5-甲基水杨酸的间接竞争 ELIS A法。利用5-甲基水杨酸抗体与对甲酚之间的交叉反应率,建立了检测对甲酚的间接竞争ELIS A法。将建立的方法用于实际样品的测定,并与高效液相色谱法进行比较,得到了满意的结果。
　　⑴5-甲基水杨酸人工抗原的合成与筛选。采用活化酯法和碳二亚胺联合法以及混合酸酐法两种方法进行偶联,合成出四种人工抗原。四个人工抗原的紫外全波长扫描图谱结果表明合成成功。考马斯亮蓝法测得人工抗原的蛋白质浓度分别为7.20mg/m L、5.83m g/m L、1.79 mg/mL和4.80m g/m L。同时计算半抗原和载体蛋白的偶联比分别为14.6、8、19.7和3.4。
　　⑵抗5-甲基水杨酸抗体的制备与鉴定。用偶联比分别为14.6与3.4的免疫原免疫新西兰大白兔,经过免疫后采集全血,间接竞争ELIS A测定抗体效价分别为256000和64000,蛋白质浓度分别为18.02mg/mL和20.97 mg/mL。
　　⑶间接竞争酶联免疫吸附法的建立。以上述制备的抗原抗体为材料,通过对包被原和抗体浓度,封闭液等六个条件的优化,得到了5-甲基水杨酸的间接竞争ELIS A条件为:稀释倍数为128000的包被原和稀释倍数为40000的抗体,封闭液为0.5％O VA,二抗稀释倍数为2500,封闭2h,一抗温育1h,二抗温育1h。采用优化后的条件,以浓度对数值和抑制率建立检测5-甲基水杨酸的标准工作曲线:y=-14.31x+81.10,R2=0.944,半数抑制浓度为149.04 ng/m L,最低检测限为4.19ng/m L。检测到制备的抗体与对甲酚有较大的交叉反应率,利用这一特点建立了标准工作曲线:y=-12.18x+74.97, R2=0.996,半数抑制浓度为112.23ng/mL。最低检测限约为17.14ng/mL。对所建立的两个方法进行了特异性评价,结果符合要求。
　　⑷用ELIS A法测定实际样品并与仪器方法进行比较。采集化妆品样品和水样分别检测其中的5-甲基水杨酸和对甲酚。HP LC检测5-甲基水杨酸的回归方程:y=9199x-44776 R2=0.991;检测对甲酚的回归方程:y=9199x-44776 R2=0.991。免疫分析与色谱分析得到的数据具有一致性。对间接竞争ELIS A法检测化妆品中5-甲基水杨酸和水样中对甲酚进行了加标回收率的测定,前者的为97.25%~103.90%,后者为97.50%~10.67%,符合要求。方法准确可靠,能用于实际样品的测定。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

第一章 绪论

1.1课题研究背景

1.2课题研究对象

1.4酶联免疫吸附方法介绍

1.5课题研究的目的与意义

1.6研究的创新点与技术路线

第二章 5-甲基水杨酸免疫原的合成与筛选

2.1基本概念和原理

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4结果与讨论

2.5本章小结

第三章5-甲基水杨酸抗体的制备与鉴定

3.1基本概念和原理

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4结果与讨论

3.5本章小节

第四章5-甲基水杨酸与对甲酚间接竞争ELISA检测方法的建立

4.1基本概念和原理

4.2实验材料

4.3实验方法

4.4结果与讨论

4.5本章小节

第五章环境样品中5-甲基水杨酸和对甲酚的测定

5.1基本概念和原理

5.2 实验材料

5.3实验方法

5.4结果与讨论

5.5本章小节

第六章总结

参考文献

致谢

攻读硕士学位期间已发表或录用的论文