SrGAP2分子F-BAR结构域的可逆乙酰化修饰及其功能研究

摘要

SrGAP家族(Slit-Robo GTPase-activating proteins)主要有srGAP1、srGAP2、srGAP3和ARHGAP4四个家族成员组成。SrGAP分子包含N端F-BAR结构域,主要介导细胞膜形态的变化,中间 RhoGAP结构域特异性水解 RhoGTPase,C端SH3结构域介导蛋白与蛋白之间的相互作用。
　　目前的研究揭示接头蛋白srGAP分子主要通过它的F-BAR结构域发挥着多种重要的功能.如srGAP1在线虫胚胎形成过程中通过其F-BAR介导细胞之间的粘附作用;srGAP2的 F-BAR结构域能诱导神经元突起的生长和迁移;srGAP3的F-BAR能促进树突棘发育的起始。而且,这种作用被证明与F-BAR结构域丝状伪足(filopodia)诱导活性密切相关。F-BAR结构域的作用机制被认为与其结构域中存在大量带正电荷的碱性氨基酸有关;这些赖氨酸(Lysine)和精氨酸(Argine)可以通过静电相互作用与细胞膜表面带负电荷磷脂相结合,介导细胞膜表面的形态变化。
　　本研究聚焦srGAP2的F-BAR/IF-BAR结构域关键赖氨酸(Lysine)的可逆乙酰化修饰及其对Filopodia诱导和内吞功能的影响。
　　获得的主要结果如下:
　　1.我们在COS7L和HEK293FT等细胞系上转染C端融合有GFP标签的srGAP-F-BAR/IF-BAR,结果观察到 GFP-srGAP(1-3)F-BAR主要分布于细胞膜,并且诱导 Filopodia形成。进一步,我们利用纯化的重组GST-srGAP(1-3)F-BAR蛋白进行了膜脂结合实验Membrane Lipid assay, srGAP(1-3)F-BAR主要与PA、PtdIns(4)P、PtdIns(4,5)P2、PtdIns(3,4,5)P3等磷脂结合。
　　2.使用Cluster X软件进行序列比对不同种属的srGAP分子F-BAR结构域,发现在所有50个赖氨酸中具有多个进化中高度保守的关键赖氨酸,将srGAP2-F-BAR载体转染到HEK293FT,24-48小时后,裂解物用抗体检测,发现F-BAR存在乙酰化修饰,而经过去乙酰化抑制剂TSA/NAM处理后,乙酰化水平升高。我们选择两个关键赖氨酸位点制备了 Ac-K226和Ac-K234抗体,进一步证明K226和K234位点存在乙酰化修饰。
　　3.我们利用Co-IP和Western Blot等手段筛选以srGAP2作为底物的去乙酰化酶和乙酰化转移酶。结果显示,SIRT1和p300与srGAP2有相互作用;SIRT1与srGAP2共转染后,能降低其乙酰化水平;p300与srGAP2共转染后,能增加其乙酰化水平。
　　4.我们以srGAP2-F-BAR-WT为模板多位点突变获得2KQ和5KQ模拟乙酰化突变体以及6 KR模拟去乙酰化突变体。功能研究发现:srGAP2-F-BAR-WT具 filopodia诱导和促进细胞迁移的功能;然而模拟乙酰化修饰的5KQ丧失了filopodia诱导和细胞迁移的功能,而转变为促进细胞内吞;模拟去乙酰化修饰的6KR具有抑制神经元分化的能力。
　　综上所述,我们的研究初步证明srGAP2-F-BAR结构域存在可逆的乙酰化修饰;p300是它的乙酰化酶,Sirt1是它的去乙酰化酶(也可以说,p300和SIRT1参与srGAP2 F-BAR乙酰化修饰作用)。进一步的功能研究揭示srGAP2分子F-BAR结构域的可逆乙酰化修饰作用可以调控filopodia诱导和内吞(endocytosis)之间的功能转换。该研究将为研究作为信号接头蛋白的srGAP2的多样的功能及作用机制提供了一个崭新的思路。

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第1章 绪 论

1.1乙酰化修饰

1.1.1乙酰化修饰概述

1.1.2组蛋白乙酰化修饰

1.1.3组蛋白乙酰化转移酶HAT

1.1.4组蛋白去乙酰化酶HDAC家族

1.1.5组蛋白去乙酰化酶抑制剂HDACi

1.2 SrGAP家族

1.2.1 SrGAP家族分子及功能结构域

1.2.2 SrGAP家族分子在神经元发育中的重要作用

1.2.3 SrGAP 家族的翻译后修饰

第2章 材料和方法

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

2.1.2实验动物

2.1.3细胞系

2.1.4载体与质粒

2.1.5实验室试剂

2.1.6抗体

2.1.7试剂配方

2.1.8引物

2.2实验方法

2.2.1 感受态细胞的制备

2.2.2 GST融合蛋白表达与纯化

2.2.3 HEK293FT、Neuro2a和COS7L等细胞系培养和细胞转染

2.2.4抽提蛋白样品及蛋白样品制备

2.2.5抽提大脑皮层组织样品与制备

2.2.6免疫细胞染色

2.2.7免疫共沉淀反应（Co-IP）

2.2.8蛋白免疫印迹

2.2.9 Neuro2a细胞系诱导神经元分化模型

第3章 实验结果

3.1 F-BAR功能结构

3.1.1 SrGAP家族分子的F-BAR功能结构

3.1.2 SrGAP分子F-BAR结构域与膜脂的结合

3.2 SrGAP2分子F-BAR结构域乙酰化修饰

3.2.1 SrGAP2分子F-BAR结构域序列分析

3.2.2 SrGAP2分子F-BAR结构域存在乙酰化修饰

3.3寻找 srGAP2的HDAC和HAT

3.3.1筛选HDAC家族分子

3.3.2 SrGAP2与SIRT1的共定位

3.3.3 SIRT1敲除小鼠的鉴定和体内srGAP2乙酰化修饰

3.3.4筛选HAT分子

3.4 SrGAP2乙酰化抗体的制备与检测

3.4.1乙酰化抗体的制备与鉴定

3.4.2乙酰化抗体检测

3.4.3体内srGAP2乙酰化修饰

3.5 SrGAP2分子F-BAR结构域模拟乙酰化和去乙酰化突变体

3.5.1构建模拟乙酰化和去乙酰化突变体

3.5.2乙酰化修饰对其亚细胞定位的影响

3.5.3 SrGAP2分子F-BAR结构域乙酰化水平

3.6乙酰化修饰的功能转换

3.6.1乙酰化修饰促进细胞内吞

3.6.2乙酰化修饰与Rab家族

3.6.3伤口愈合研究

3.6.4诱导神经元分化

3.6.5乙酰化修饰对其信号通路分子的调控

第4章 讨论

4.1乙酰化修饰的功能转换

4.2 SIRT1与神经发育

4.3乙酰化修饰与神经发育

第5章 结论和展望

参 考 文 献

致谢

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