人包皮来源成纤维细胞支持小鼠胚胎干细胞自我更新和疾病患者诱导多能干细胞的研究

摘要

本论文利用体外培养的多能干细胞(pluripotentstemcells)，进行了以下两个部分的研究:
　　（一）人包皮来源成纤维细胞(humanforeskinfibroblast，HFF)分泌白细胞介素6(interleukin6，IL6)支持小鼠胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES细胞）自我更新的研究。
　　胚胎干细胞具有无限自我更新和多向分化潜能两大特征，成为研究哺乳类动物早期发育分子机制和进行药物筛选的理想细胞模型。同时，它们是细胞治疗所需功能细胞的无限来源。然而，实现ES细胞的这些应用潜能需要稳定、优化的ES细胞培养体系。在目前普遍采用的小鼠ES细胞培养体系中，除需要白血病抑制因子(leukemiainhibitoryfactor，LIF)外，ES细胞生长在经特殊处理的小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast，MEF)上。因此，频繁的MEF原代分离培养和价格不菲的LIF使ES细胞培养变得繁琐和昂贵。在本研究中，我们发现HFF能够在不添加外源LIF的情况下支持小鼠ES细胞的生长及建系。与MEF不同，HFF能够在体外长期传代培养并保持其本身特性不变，避免了频繁的原代分离培养。利用HFF进行小鼠ES细胞的培养不需要外源LIF，使得培养体系高效，稳定和经济。我们在探索HFF不依赖外源LIF支持小鼠ES细胞生长的机制时，发现HFF通过分泌高水平的IL6，激活JAK-Stat3信号通路，实现支持小鼠ES细胞自我更新的功能。
　　（二）克氏综合症(KlinefelterSyndrome，KS)和阿尔茨海默病(Alzheimer'sDisease，AD)疾病患者来源诱导多能干细胞（inducedpluripotentstemcells，iPS细胞）的研究
　　iPS细胞是在确定的体细胞重编程因子作用下，由分化的体细胞去分化而来的多能干细胞。与胚胎干细胞相似，iPS细胞具有无限自我更新和多向分化潜能。因此iPS细胞，特别是疾病患者体细胞来源的iPS细胞具有为研究相关疾病提供体外疾病细胞模型的潜能。
　　KS是一种性染色体遗传的常见疾病，患者临床表现为先天性的睾丸发育不全。目前，由于实验材料的缺乏，其发病机制尚不清楚，导致有效治疗手段的缺乏。在本研究中，我们建立了四株KS患者包皮成纤维细胞来源的iPS细胞系。这些细胞符合iPS细胞的国际鉴定标准。同时，KS-iPS细胞具有向生殖谱系分化的潜能。在KS-iPS细胞中，一条X染色体发生了灭活。通过转录组的分析，我们发现在KS-iPS细胞中与KS患者临床症状相关基因的异常表达。因此，我们的研究表明KS-iPS细胞可以作为研究KS疾病的潜在的细胞模型。
　　AD是影响老年人健康的最主要的神经退行性疾病之一，目前尚无非常有效的治疗方法。我们建立了两个携带有Presenilin1基因突变的家族性AD患者体细胞来源的iPS细胞，目前正在按照国际标准对其进行鉴定并检测它们是否能作为研究AD疾病的体外模型。
　　以上研究为优化多能干细胞体外培养体系和利用疾病iPS细胞探索疾病发生机制及新的治疗方案奠定了基础。

目录

声明

摘要

符号说明

1．第一部分 人包皮来源成纤维细胞支持小鼠胚胎干细胞自我更新的研究

1．1 引言

1．1．1 胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES细胞)简介

1．1．2 胚胎干细胞的生物学特征及鉴定标准

1．1．3 小鼠ES细胞的体外培养及相关的信号通路

1．2 实验材料和方法

1．2．1 实验材料

1．2．2 实验方法

1．3 实验结果

1．3．1 HFF不依赖外源LIF支持小鼠ES细胞的生长

1．3．2 在不添加外源LIF的情况下，HFF支持小鼠ES细胞生长的能力优于MEF体系

1．3．3 在不添加外源LIF的情况下，HFF能够支持小鼠ES细胞的建系

1．3．4 JAK-Stat3通路在HFF支持小鼠ES细胞生长中发挥重要作用

1．3．5 HFF通过分泌IL6支持小鼠ES细胞的生长

1．4 讨论

2．第二部分 克氏综合症和阿尔茨海默病患者来源诱导多能干细胞的研究

2．1 引言

2．1．1 体细胞重编程(somatic cell reprogramming)

2．1．2 诱导多能干细胞(induced pluripotent stem，iPS细胞)

2．1．3 克氏综合症(Klinefelter Syndrome，KS)

2．1．4 X染色体失活(X chromosome inactivation，XCI)

2．1．5 阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)

2．2．实验材料和方法

2．2．1 实验材料

2．2．2 实验方法

2．3 实验结果

2．3．1 建立克氏综合症患者iPS细胞系

2．3．2 鉴定克氏综合症患者iPS细胞系

2．3．3 检测克氏综合症患者iPS细胞中X染色体失活情况

2．3．4 分析克氏综合症患者iPS细胞转录组分析

2．3．5 诱导克氏综合症患者iPS细胞向生殖谱系分化

2．3．6 建立阿尔茨海默患者iPS细胞系

2．3．7 鉴定阿尔茨海默患者iPS细胞系

2．4 讨论

2．4．1 克氏综合症疾病iPS细胞

2．4．2 AD疾病iPS细胞

3．结论

参考文献

在读期间发表学术论文

致谢