基于纳米孔和纳米阵列的单分子DNA测序技术基础研究

摘要

纳米孔测序是最有望实现“$1,000 Genome”目标的技术之一。近年来,研究较多的纳米孔有蛋白质纳米孔和硅基材料的固态纳米孔。蛋白孔寿命比较短,而基于硅基底的固态纳米孔深度显著超过单链DNA相邻碱基的间距,所以,无法实现DNA的单个碱基的分辨。作者用聚焦离子束先制造氮化硅基底,并在该基底上铺设石墨烯,再用聚焦电子束刻蚀石墨烯,获得直径10 nm以下的纳米孔,初步检测了DNA穿越纳米孔时产生的电信号,向单层石墨烯纳米孔测序DNA迈出了一步。
　　此前,我们已提出外切酶-纳米孔测序方法,即跨膜电场下外切酶在负极降解单分子 DNA,释放的4种带负电荷脱氧核苷5‘一磷酸(dNMPs)有序穿越纳米孔,它们因空间结构不同,过孔时的Ib(阻滞电流)各异,也能解决相邻碱基不易单独识别的问题。通过对单壁碳纳米管(SWNT)的选择与纳米孔切片厚度的控制获得实验需要的纳米孔孔径和孔深,我们检测了dNMPs的电信号,并对其进行了初步分析。
　　同时,我们设计了单分子纳米坑阵列芯片,它将使第二代测序中的多分子扩增芯片单分子化,从而将二代测序升级为更为有效的第三代测序技术。制备单分子芯片的第一步是获得单根DNA-STV复合物,带生物素(biotin)的DNA与抗链霉生物素(streptavidin,STV)复合会出现五种结构,通过琼脂糖凝胶电泳及电洗脱,获取单根DNA-STV复合物;其次,在超薄平整石英(quartz)表面采用离子溅射(ion sputter)镀金膜约30nm厚,然后采用聚焦离子束刻蚀表面金膜,打出间距500 nm的直径约30 nm的纳米坑阵列,获得设计的纳米坑基底;最后,对石英表面功能化并将DNA-STV复合物进行荧光染料处理之后固定进纳米坑,紧接着采用全内反射荧光显微镜(Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy,TIRFM)进行荧光检测。

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第1章 绪论

1.1引言

1.2 DNA测序技术进展

1.3研究内容

第2章 基于纳米孔的单分子DNA测序基础研究

2.1材料与仪器

2.2方法

2.3结果与分析

第3章 基于纳米阵列的单分子DNA测序基础研究

3.1材料与仪器

3.2方法

3.3结果与分析

第4章 结论

4.1总结与分析

4.2进一步工作研究

参考文献

致谢

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